综述：非蛋白质类泛素化研究进展

本文聚焦非蛋白质类泛素化，详细介绍了磷脂、碳水化合物等多种非蛋白质底物的泛素化修饰过程、相关酶以及生物学功能，探讨了研究中面临的挑战，为深入理解泛素（Ub）系统提供了全面视角，助力相关领域研究。

　　

引言

泛素化在细胞功能调节中意义重大，它是将 8kDa 的泛素（Ub）共价连接到底物上的过程，需 E1、E2、E3 三种酶依次作用。传统的泛素化是 Ub 的 C 末端甘氨酸与蛋白质底物中赖氨酸残基的 ε - 氨基形成异肽键，但近年来发现了非赖氨酸残基的泛素化，如与半胱氨酸形成硫酯键、与丝氨酸和苏氨酸形成氧酯键等。同时，还涌现出多种非蛋白质类底物，这极大地拓展了泛素化的功能范畴，本综述将深入探讨这些非蛋白质类底物的泛素化机制及相关研究挑战。

Ub 和 Ub 样蛋白对磷脂的修饰

磷脂酰乙醇胺（PEs）可作为泛素化的底物。在酵母细胞中，内体和液泡膜上的 Ub 会通过其 C 末端甘氨酸与 PE 的氨基相连，此修饰由 Uba1、Ubc4 和跨膜 E3 泛素蛋白连接酶 1（Tul1）催化。这种修饰在哺乳动物和杆状病毒中也存在。除 Ub 修饰外，PE 还能与 Ub 样蛋白（UBLs）结合，如自噬相关蛋白 8（Atg8）可与 PE 形成酰胺键，该过程由 Atg7、Atg3 和 Atg12 - Atg5 复合物等酶催化，Atg8 - PE 修饰与膜曲率变化有关，参与自噬体形成。此外，NEDD8 和 ISG15 等 UBLs 也能与哺乳动物细胞中的磷脂结合。不过，目前关于 Ub 或 UBLs 修饰 PE 的生理功能仍存在诸多疑问，在研究其具体作用时也面临困难，比如难以确定人细胞中负责 PE 泛素化的酶，且缺乏调节 PE 泛素化的工具。

Ub 对碳水化合物的修饰

RING - between - RING（RBR）E3 连接酶血红素氧化 IRP2 泛素连接酶 - 1（HOIL - 1）不仅能使蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸泛素化，还能使糖原和直链葡萄糖单泛素化，形成氧酯键。Ub 与直链葡萄糖（如麦芽庚糖）的结合发生在葡萄糖的 C6 - 羟基部分。Met1 或 Lys63 连接的 Ub 链可激活 HOIL - 1，增强麦芽庚糖的泛素化，HOIL - 1 还能将预先组装的 Ub 链连接到直链葡萄糖上。但 HOIL - 1 是否含有碳水化合物结合位点尚不明确，虽然它是线性 Ub 链组装复合物（LUBAC）的组成部分，LUBAC 中的 SHARPIN 和 HOIP 能与直链多糖结合，这可能有助于 HOIL - 1 对直链多糖的泛素化，但它们之间的联系尚未确定。在小鼠中，HOIL - 1 的 E3 连接酶活性对防止多葡聚糖沉积至关重要，不过其体内防止多葡聚糖沉积的活性与体外直链葡萄糖泛素化之间的关系也有待明确。

SCF^FBS2 - ARH1 可使天冬酰胺连接的 N - 乙酰葡糖胺（N - GlcNAc）泛素化。内切 β - N - 乙酰葡糖胺酶催化 N - 聚糖去糖基化生成 N - GlcNAc，为核因子红细胞 2 - 样 1（Nrf1）上的泛素化提供受体位点。SCF^FBS2 - ARH1 与 ARH1 相关的 E2（UBE2L3）协同作用，通过氧酯键使 N - GlcNAc 基序在 6 - 羟基处泛素化。Man₃GlcNAc₂对 FBS2 结合及糖肽的 Ub 修饰至关重要。SCF^FBS2 - 依赖的 Nrf1 多泛素化可抑制其被 DDI2 激活，具有潜在的生理意义，但目前尚未在预测的内源性底物 Nrf1 上检测到泛素化的 N - GlcNAc 基序。

此外，UBE2J2、UBE2Q1 和 UBE2Q2 等 E2 也能催化甘油和葡萄糖残基的泛素化，UBE2J2 和 UBE2Q1 还可使麦芽庚糖泛素化。

Ub 对糖脂的修饰

糖脂也是一类新发现的非蛋白质类泛素化底物。RING E3 连接酶 RNF213 可使入侵胞质的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）的脂多糖（LPS）的脂质 A 部分泛素化，形成的结合物是细菌 Ub 包被形成的基本元件。RNF213 对 LPS 的泛素化不依赖其 RING 结构域，而是需要其动力蛋白样核心中的催化活性 AAA + 结构域结合 ATP 以及第四个 AAA + 结构域的 ATP 水解活性，RZ 指结构也必不可少，其中 His⁴⁵⁰⁹对 RNF213 介导的 LPS 泛素化及 Ub 包被形成至关重要。虽然脂质 A 的修饰位点尚不清楚，但已知该连接对碱性条件敏感，表明涉及羟基。

LUBAC 的活性依赖于沙门氏菌上预先存在的 Ub 修饰，RNF213 介导的 LPS 泛素化可能招募 LUBAC 的 HOIP，将 LPS 的泛素化与生理功能联系起来。HOIP 可使 Met1 连接的 Ub 连接到单泛素化的 LPS 上，导致细胞内细菌通过自噬介导的溶酶体降解，同时激活 NF - κB，促进感染细胞分泌促炎介质，限制胞质细菌增殖。RNF213 还能识别革兰氏阳性的单核细胞增生李斯特菌、寄生虫弓形虫和病毒等病原体，并在这些病原体上形成 Ub 包被，但这些病原体上被泛素化的配体尚未确定，RNF213 识别多种病原体的机制也有待研究。

Ub 对二磷酸腺苷核糖的修饰

二磷酸腺苷核糖（ADPr）的泛素化修饰揭示了不同翻译后修饰之间可能存在相互作用。最初认为该修饰由 PARP9 催化，后证实是 RING E3 连接酶 DTX3L 的作用。DELTEX 家族成员都能催化 Ub 与 ADPr 的结合，其保守的 C 末端 RING 结构域和 DELTEX - C 末端结构域（DTC）是最小催化片段。Ub 与 ADPr 的修饰是通过 Ub 的 Gly⁷⁶与 ADPr 的腺嘌呤近端核糖环的 3′ - 羟基形成氧酯键。由于 3′ - 羟基也存在于 NAD⁺、AMP 和 ADP 的腺嘌呤核糖中，DELTEX E3s 在体外也能使这些分子泛素化。

DTC 结构域含有结合 ADPr 和 NAD⁺的口袋，可招募经多 ADPr 修饰的底物，使 ADPr 部分泛素化。除游离的 ADPr 外，ADPr 修饰的蛋白质和核酸上的 ADPr 部分也能被泛素化。在 DTX2 的 DTC 结构域口袋中，His⁵⁹⁴对 ADPr 结合很重要，His⁵⁸²和 Glu⁶⁰⁸等保守催化残基与 ADPr 形成类似线性催化三联体的结构，激活腺嘌呤核糖的 3′ - 羟基进行泛素化。目前，只有蛋白质上 ADPr 部分的泛素化与生物学功能相关，即单 ADP - 核糖基化（MARylated）的 PARP10 的 Ub 修饰会使其被 K11 连接的 Ub 链延伸，进而被蛋白酶体降解。

Ub 对核酸的修饰

核酸也可作为泛素化的底物，单链 RNA（ssRNA）和单链 DNA（ssDNA）能被 DTX3L 泛素化，Ub 与 3′核苷酸的核糖环 3′ - 羟基形成氧酯键。DTX3L 修饰单链核酸仅需 RING 和 DTC 结构域，ssDNA 与 ADPr 竞争结合 DTC 结构域中的同一口袋，突变与 ADPr 结合相关的位点会影响 ssDNA 的 Ub 修饰，这表明单链核酸和 ADPr 的 Ub 修饰机制有相似之处。

DTX3L 对 ssDNA 和 NAD⁺的催化效率受底物浓度影响，细胞微环境中底物的局部浓度可能调节 DTX3L 的底物特异性。在 DELTEX E3 家族中，只有 DTX3L 和 DTX3 能使核酸泛素化。结构预测显示，DTX3L 和 DTX3 的 N 端可能含有 RRM 和 / 或 KH 样折叠结构域，这些结构域虽不是单链核酸泛素化所必需的，但可能有助于核酸结合并影响底物特异性。DTX3L 和 DTX3 的 DTC 结构域中独特的 Ala - Arg 基序对核酸泛素化至关重要，但并非唯一决定因素，且 DTX3L 的 RING 和 DTC 结构域的空间排列对核酸的 Ub 修饰也很重要。尽管体外有充分证据支持核酸的 Ub 修饰，但在细胞环境中检测该修饰并明确其功能仍面临技术挑战。

去泛素化酶

泛素化的可逆性对 Ub 信号调节至关重要，去泛素化由去泛素化酶（DUBs）催化，人体基因组中约有 100 种 DUBs。对于大多数非蛋白质类底物，细胞中负责切割其 Ub 修饰的特定 DUBs 知之甚少。酵母细胞中的内体 DUB Doa4 可使 Ub - PE 去泛素化，而其他许多非蛋白质类 Ub 底物的去泛素化酶尚未确定，部分仅在体外进行过研究。例如，人泛素特异性肽酶 2（USP2）和 SARS - CoV - 2 PLpro 可切割 Ub - ADPr，USP2 也能切割 Ub - ssDNA 和 ssRNA，但 USP2 是非特异性 DUB，无法确定这些底物在细胞中是否会被其切割。此外，Nrf1 中泛素化的 Ser / Thr 残基和 N - GlcNAc 基序对 DUB 活性有一定抗性，这使得这些修饰的调节机制存在疑问，推测细胞中可能存在高度特异性的酶来去除非蛋白质类底物上的 Ub。

挑战

目前大多数非蛋白质类底物的研究主要在体外进行，与细胞功能的关联较少。从细胞环境中识别和分离泛素化底物是一大挑战，可能存在尚未发现的条件促使这些修饰产生，而且 Ub 系统处于平衡状态，非蛋白质类底物的 Ub 修饰可能会被逆转，如 Ub - ADPr 因连接不稳定和被 DUBs 切割，在细胞中含量低，难以检测，需过表达 DTX2 才能检测到。利用能识别这些底物的工具，如 Af1521 宏结构域可富集 Ub - ADPr，开发针对非蛋白质类泛素化底物的纳米抗体也可能有助于检测和验证，但对于特征不明确的泛素化物种，开发检测工具难度较大。质谱方法和代谢组学方法的进步有助于进一步表征非蛋白质类泛素化底物。

确定能够修饰非蛋白质类底物的 E3s 也面临挑战，虽然 RNF213 和 DELTEX E3s 的研究为识别和验证这类 E3s 提供了不同策略，但不能仅根据序列预测 E3s 的活性。体外筛选 E3s 对多种非蛋白质类底物的亲和力和活性是一种潜在方法，但该方法通量低，且检测修饰时需针对每个底物进行优化，基于质谱检测不稳定氧酯键的方法也有待完善。不过，对非蛋白质类底物泛素化的认识不断加深，正推动相关研究策略和技术的发展。

展望

众多非蛋白质类泛素化底物的发现拓展了泛素（Ub）系统，其多样性表明 Ub 的作用比传统的翻译后修饰更为广泛和复杂。未来研究应着重开发工具和技术，深入探究这些修饰的生物学意义，这将有助于进一步揭示泛素系统的奥秘，推动生命科学和健康医学领域的发展。