纳米盐菌源异源视紫红质中视网膜发色团光异构化对增强内向质子泵活性的作用机制研究

本研究针对异源视紫opsin（XeR）与经典外向质子泵菌视紫红质（BR）的质子转运方向性差异机制这一核心科学问题，通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）等技术解析纳米盐菌源XeR（NsXeR）早期光中间态特征，首次发现其视网膜发色团在13-顺式构型转化时保持无扭曲特性，且第二抗衡离子位点Pro209突变会恢复氢原子面外振动（HOOP）信号并降低泵活性，揭示了光异构化过程中视网膜构象松弛性对增强内向质子转运效率的关键作用，为光驱动膜蛋白的矢量控制提供了新见解。

　　

在生命活动中，质子动力势（PMF）的生成与利用是能量转换的核心环节。微生物通过视紫红质家族蛋白实现光能驱动的质子跨膜转运，其中经典的外向质子泵如菌视紫红质（BR）的机制已被深入解析，而近年来发现的异源视紫红质（XeR）却展现出截然相反的内向质子泵活性。这种质子转运方向性的分子开关机制成为领域内亟待破解的谜题。更引人注目的是，来自纳米盐菌的XeR（NsXeR）表现出显著高于其他同源蛋白的泵活性，但其增效机制始终未被阐明。

日本研究人员通过多学科技术联用，揭示了NsXeR高效内向泵活性的结构基础。研究发现，NsXeR在第二抗衡离子位点（BR中Asp212对应位置）保守性地缺失负电荷残基，取而代之的是脯氨酸（Pro209）。这种独特结构可能通过调控质子化希夫碱（PRSB）的微环境，影响质子传递路径的选择性。

研究团队采用低温傅里叶变换红外光谱（FTIR）捕捉NsXeR的早期光中间态（K态），发现其光谱在1200-1000 cm^-1区域缺乏氢原子面外振动（HOOP）特征峰，表明视网膜发色团在从全反式转为13-顺式构型时保持构象松弛。这与外向泵BR及同类内向泵PoXeR形成鲜明对比——后者均显示强烈的HOOP振动信号，提示发色团扭曲。进一步分析显示，NsXeR中PRSB的N-H键在暗态下氢键作用较弱，而将Pro209突变为丙氨酸或甘氨酸（P209A/P209G）后，不仅恢复了HOOP振动特征，还增强了PRSB氢键网络。

功能实验证实这些结构变化与泵活性密切相关：野生型NsXeR展现出最快的质子转运速率和热异构化恢复动力学，而P209A/P209G突变体的内向泵活性显著降低。时间分辨光谱显示，突变体在最终热异构化步骤存在明显延迟，说明Pro209通过维持发色团构象松弛性，优化了光循环后期的构象重置效率。

技术方法上，研究结合低温FTIR光谱（77 K）解析发色团构象变化，通过定点突变（P209A/G）进行结构-功能关联分析，采用闪光光解技术测定质子泵活性，并利用紫外-可见（UV-Vis）光谱监测光循环中间态动力学。

【光异构化实现全反式视网膜发色团向13-顺式形式的转化且不增加NsXeR的扭曲】
通过77 K下的FTIR差谱分析，发现NsXeR在1242、1202和1173 cm^-1处出现负峰（全反式构型特征），1191 cm^-1处正峰（13-顺式构型特征），但HOOP区域（1000-900 cm^-1）未见特征峰，表明其光异构化过程不引起显著发色团扭曲。

【NsXeR的K中间态中视网膜发色团具有13-顺式构型且多烯链扭曲最小】
对比PoXeR和ASR(D217E)等内向泵的强烈HOOP信号，NsXeR独特的无扭曲异构化特征提示其PRSB的N-H在光激发后更易朝向胞质侧，为后续质子释放创造有利取向。

【结论】
研究首次阐明视网膜发色团的光异构化构象动力学与质子泵矢量性的内在关联：NsXeR通过Pro209维持发色团构象松弛性，使PRSB在去质子化时自然朝向胞质侧，从而优化内向质子传递路径。这一发现不仅解释了NsXeR超高活性的结构基础，更为设计新型光遗传学工具提供了理论框架——通过精确调控发色团扭曲程度可能实现质子泵方向性的理性设计。论文发表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics》，为膜蛋白矢量转运研究树立了新范式。