三维人肺上皮模型在常氧与缺氧条件下的形态学特征及氧状态表征

研究人员针对感染导致组织局部缺氧影响细胞生存和炎症调控的关键问题，开展了一项关于三维人肺上皮模型（LLI/cALI）在常氧（normoxia）与缺氧（hypoxia）条件下的形态学及分子响应研究。通过对比Calu-3细胞和原代hBEC模型，发现不同培养方式（LLI/cALI）显著影响上皮复杂性、细胞外氧耗模式及HIF-1α/2α/3α和ACE2蛋白表达水平。该研究为呼吸道感染和炎症的体外模拟提供了更接近生理状态的实验模型，对推动3R原则下的替代动物实验具有重要意义。

　　

在呼吸道感染过程中，局部组织缺氧会触发细胞生存反应并调控炎症进程，但传统体外研究常忽略氧状态这一关键参数。目前，大多数实验仍采用常氧条件（18.6% O₂）下的单层细胞模型（CM），其生理相关性有限。为填补这一空白，来自德国汉诺威医学院等机构的研究团队在《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》发表论文，系统评估了液液界面（LLI）、经典气液界面（cALI）和原代支气管上皮细胞（hBEC）模型在常氧与缺氧（1% O₂）条件下的形态学特征、氧动态及分子响应。

研究采用跨上皮电阻（TEER）测量评估屏障完整性，通过实时氧传感技术监测细胞外氧耗，结合组织化学染色、免疫组化、Western blot和ELISA分析HIF-1α/2α/3α及ACE2蛋白表达，并利用qPCR检测基因转录变化。所有模型均使用来自3名成人捐赠者的原代hBEC或商业化Calu-3细胞系构建。

3.1 高屏障完整性上皮的形成
Calu-3和hBEC在cALI培养28天后形成假复层或复层上皮，TEER值分别超过300 Ωcm²和200 Ωcm²，而LLI模型仅形成单层结构，表明cALI更接近体内生理状态。

3.2 上皮形态与分泌功能的模型依赖性差异
hBEC cALI模型展现出最高的复杂性（4-6层细胞）和黏液分泌能力，Alcian blue染色显示其黏液蛋白聚糖含量显著高于Calu-3模型。免疫组化证实hBEC能形成真正的顶-基底极性，而Calu-3仅呈现顶表型。

3.3 细胞外氧耗的特征性模式
缺氧条件下所有模型在6-7小时内耗尽氧，但常氧时呈现显著差异：Calu-3 LLI和cALI模型的氧含量24小时后分别降至5%和4%，而hBEC cALI稳定在13-14%，提示原代细胞可能通过顶侧获取更多氧气。

3.4 缺氧响应关键介质的组织学特征
免疫组化显示HIF-1α在缺氧时轻微增加，但核定位有限；HIF-2α在所有条件下均高表达，表明其氧敏感性较低。PHD1/2的表达不受氧状态影响，但存在细胞类型依赖性差异。

3.5 HIF-α蛋白稳定的模型依赖性
ELISA揭示Calu-3 LLI在缺氧时HIF-1α显著增加，而hBEC cALI中HIF-3α升高。Western blot检测到Calu-3存在降解型HIF-1α条带，hBEC则出现未加工全长蛋白，提示细胞类型特异的HIF处理机制。

3.6 缺氧诱导的ACE2蛋白水平变化
Western blot显示Calu-3 LLI在缺氧时ACE2显著降低，而cALI模型变化不显著。hBEC的ACE2表达呈现供体间差异，但不受缺氧影响。糖基化分析表明培养方式影响ACE2翻译后修饰。

3.7-3.8 特殊模型（iALI/CM）的特征
倒置气液界面（iALI）模型因持续增殖而缺乏分化，但能维持较好的氧稳态；传统单层（CM）则表现出严重的氧耗（24小时后降至10-11% O₂）。基因分析显示iALI中VEGF缺氧上调幅度是CM的两倍，凸显培养格式对缺氧响应的调控作用。

该研究首次系统比较了不同肺上皮模型的氧动力学特征，揭示常氧培养时Calu-3模型实际处于缺氧状态（4-5% O₂），而hBEC cALI能维持近生理氧水平。这一发现对优化感染研究模型至关重要，尤其为COVID-19等涉及低氧血症的疾病机制研究提供了更可靠的体外工具。研究还证实ACE2表达受培养格式和氧状态双重调控，为解释SARS-CoV-2感染的细胞选择性提供了新视角。通过建立标准化缺氧响应评估体系，该成果推动了3R原则下替代动物实验的进程，并为个性化呼吸道疾病模型的开发奠定基础。