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这篇综述聚焦生物系统中超氧阴离子（O2•ˉ）的电化学检测。详细探讨了检测方法，包括酶促和非酶促检测及其优劣势，还介绍了体外和体内检测策略，阐述其在氧化应激监测和疾病诊断中的临床意义，为相关研究提供全面参考。
1. 引言
超氧阴离子（O2•ˉ）作为一种活性氧物种，在生物系统中具有重要作用。它由分子氧的单电子还原产生，在吞噬细胞防御机制和细胞呼吸过程中发挥关键作用。适量的 O2•ˉ参与细胞信号传导，但当其积累时，会引发氧化应激，导致蛋白质、细胞和组织受损，与多种疾病相关，如神经退行性疾病、动脉粥样硬化和心血管疾病等。
传统检测 O2•ˉ的方法存在诸多局限性，如电子顺磁共振光谱（EPR）需使用自旋捕获剂，且在生理条件下灵敏度受限；荧光探针检测存在信号重叠问题；高效液相色谱（HPLC）虽能降低检测限，但成本高、操作复杂，难以用于活细胞或组织的动态监测。相比之下，电化学技术具有成本低、操作简便等优势，能够实现对活性氧物种的检测和动态监测，因此在生物系统中 O2•ˉ的检测研究中受到广泛关注。
2. 超氧阴离子检测：电化学视角
O2•ˉ可通过分子氧在负电位下的还原反应电化学产生，但在水溶液环境中稳定性差，且其还原过程与过氧化氢的电活性相近，难以区分。因此，在电化学检测中，需要选择合适的 O2•ˉ来源，如碱性二甲基亚砜、酚类衍生物的原位氧化或碱金属超氧盐（如 KO2）等，同时要注意避免测量干扰。此外，通过酶促反应（如黄嘌呤氧化酶催化次黄嘌呤 / 黄嘌呤转化为尿酸的过程）产生 O2•ˉ，可实现稳态下的精确检测，但该方法存在成本较高的问题。
电化学检测 O2•ˉ的策略主要分为酶促检测和非酶促检测，电极表面修饰对检测方法的选择性和灵敏度起着关键作用。
2.1 酶促检测
酶基生物传感器利用酶对特定底物的高灵敏度进行检测。在 O2•ˉ电化学检测中，常用的酶有细胞色素 c（cyt c）和超氧化物歧化酶（SOD）。
cyt c 是参与电子传递链的小血红素蛋白，也具有抗氧化酶的功能。它能与 O2•ˉ反应生成氧气和还原型 cyt c，通过监测 Fe2+-cyt c 在电极上氧化的氧化还原电流，可实现对 O2•ˉ的定量检测。例如，将 cyt c 通过物理吸附或共价结合的方式固定在电极表面，可制备 cyt c 基生物传感器。为提高传感器的灵敏度，可使用纳米材料或纳米结构表面，如纳米多孔金网，能增大酶固定化的表面积，促进电子转移，降低检测限。
SOD 是催化 O2•ˉ歧化反应的高效酶，相比 cyt c，它具有更高的催化效率和稳定性，能更有效地保护细胞免受氧化应激。SOD 基生物传感器的检测策略通常是通过识别 O2•ˉ酶促歧化反应的产物（如过氧化氢）的电活性，或利用 SOD 与 O2•ˉ相互作用时金属阳离子氧化态和电荷的变化，实现直接电信号检测。不同的 SOD 固定化策略会影响传感器的性能，如通过生物聚合物封装、交联或碳二亚胺化学法将 SOD 固定在电极表面，可提高传感器的灵敏度和稳定性。
2.2 非酶促检测
为避免酶促生物传感器的一些缺点，如蛋白质变性、重复性下降和操作条件受限等，研究人员开发了多种用于 O2•ˉ电化学检测的功能性合成材料。
纳米技术在新型传感表面的设计中发挥了重要作用。例如，碳纳米结构（如空心立方碳或多孔立方碳网络）能增加传感表面积，提高电子转移速率；贵金属纳米材料（如 Ag 或 Au 纳米颗粒）也可用于 O2•ˉ的催化检测，但部分材料存在检测电位高、信号区分困难或纳米颗粒聚集等问题。
此外，过渡金属基功能材料作为低成本的人工酶也被广泛研究。这些材料模拟天然酶的活性位点，与 O2•ˉ发生化学反应，然后通过电化学氧化或还原金属中心实现信号读出。其中，锰磷酸盐（Mnx(PO4)y）和钴磷酸盐（Co3(PO4)2）等过渡金属磷酸盐纳米结构因其稳定性和选择性而受到关注，但它们的合成过程较为复杂。为解决这些问题，研究人员探索了多种合成方法，如微乳液法、原位合成法以及利用生物分子或 DNA 模板辅助合成等。
2.3 酶促检测与非酶促检测的优势与局限
酶促生物传感器具有高特异性、生物相关性适合体内应用、灵敏度高、可重复使用以及实时快速响应等优势。其高特异性可减少其他活性氧物种或分子的干扰，确保 O2•ˉ检测的准确性；生物相关性使其在体内检测和临床诊断中具有重要价值；高灵敏度有助于检测低浓度的 O2•ˉ；可重复使用性降低了长期使用成本；实时快速响应则能满足对 O2•ˉ动态监测的需求。然而，酶促生物传感器也存在酶稳定性差和重复性随时间下降的问题。
非酶促传感器的优势在于稳定性和耐久性好、制备简单且成本效益高、操作条件宽泛、检测通用性强。它们不依赖生物酶，避免了酶的不稳定性问题，可在恶劣环境下长期使用；简单的制备过程和较低的成本使其更具经济优势；宽泛的操作条件使其适用范围更广；能够检测多种活性氧物种，使其在氧化应激检测等领域具有更广泛的应用潜力。但非酶促传感器存在选择性低和生物相容性差的缺点，不过使用 DNA 模板材料可提高其生物相容性。
3. 体外策略
电化学检测在活细胞系统基础研究中具有操作简单、能在单细胞或细胞培养环境中监测动态生物过程的优势。在体外实验中，对 O2•ˉ的研究主要集中在监测外部物质的抗氧化性能、探索细胞死亡过程中局部 O2•ˉ的产生以及动态监测细胞在物理或化学刺激下释放的 O2•ˉ。
通过检测活细胞培养中伏安或安培信号的变化，可监测食物中抗氧化剂（如茶多酚、维生素 C、β - 胡萝卜素和花青素等）对 O2•ˉ释放的影响，评估其抗氧化性能。在癌症研究中，利用电化学方法监测刺激细胞释放的 O2•ˉ，可区分健康细胞和癌细胞，研究癌细胞在高脉冲电场（PEF）下的 ROS 生成以及与细胞内 Ca2+释放的关系，为癌症治疗提供理论依据。
此外，研究不同刺激（如缺氧、紫外线暴露、温度变化、化学物质刺激等）对活细胞 O2•ˉ释放的影响，有助于深入了解细胞的生理和病理过程。例如，通过监测细菌在抗生素刺激下释放的 O2•ˉ，研究抗生素的作用机制；通过监测细胞在不同温度下对化学刺激的响应，评估细胞的抗氧化能力和对温度的耐受性。
为提高检测准确性和细胞相容性，研究人员采用了多种策略。如将活细胞直接植入传感表面，可监测特定膜位置的事件，但需考虑材料的生物相容性；使用 2D 和 3D 材料可促进细胞黏附和生长，避免细胞生长和增殖问题；通过芯片设计和微型化配置，结合敏感和选择性传感表面与细胞培养瓶，可实现对细胞生长过程中 O2•ˉ的直接监测。
4. 体内策略
体外实验虽然能揭示细胞应激和死亡的生物学途径，但体内策略能更好地在复杂的生化反应级联中区分感兴趣的途径。将体外具有优异分析性能的电化学检测方法应用于体内时，需要考虑传感器的微型化、操作参数的优化以及避免对活组织造成损伤等问题。
在体内检测中，污垢效应会严重影响 ROS 的检测。使用碳纤维、铂电极和可渗透涂层等材料可减少污垢效应。例如，用 [Fe (im) 2 (tpp)] Br 修饰的碳棒可用于监测内毒素血症大鼠循环血液中的 O2•ˉ；MUA 修饰的金电极可用于检测大鼠腿部组织缺血再灌注过程中的 O2•ˉ。
酶促生物传感器凭借其快速的动力学反应机制和低操作过电位，在体内 O
