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AGR2 作为肿瘤生物标志物，其蛋白互作组难以捕获。研究人员引入 DiZPK，在 MCF-7 细胞裂解物中进行光交联反应，鉴定出 AGR2 在细胞 - 细胞黏附通路的新蛋白伙伴。这有助于揭示 AGR2 在癌症转移中的作用机制，值得深入研究。
在癌症研究领域，一直存在着诸多待解之谜。前梯度蛋白 2（Anterior Gradient 2，AGR2）近年来成为了研究热点，它是蛋白二硫键异构酶（PDI）超家族的成员，在多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等中常常过度表达。AGR2 就像一个 “多面手”，它既能作为细胞外信号分子，又能充当细胞内内质网（ER）伴侣。在细胞内，它凭借 N 端的信号肽（M1-K20）进入内质网，成熟后信号肽被切割，进而分泌到细胞外发挥信号蛋白的作用；同时，通过内质网滞留序列（K172-L175）在 ER 中协助蛋白质折叠，维持 ER 的稳态。它的硫氧还蛋白样结构域（C81-S84）能与黏蛋白（MUC2、MUC1 和 MUC5AC）形成混合二硫键，助力黏蛋白成熟。此外，二聚化结构域（E60-K64）、reptin 结合基序（F104-Y111）和 EpCAM 结合基序（V131-L135）也在其发挥功能过程中扮演着重要角色。
然而，要想彻底弄清楚 AGR2 在癌症发生发展中的作用机制，就必须明确与它直接相互作用的蛋白质。但目前面临着一个棘手的问题，那就是捕获 AGR2 完整的蛋白质互作组十分困难。因为在传统的纯化过程中，那些与 AGR2 微弱或短暂相互作用的蛋白伙伴很容易被洗脱，导致无法被检测到。此前的研究方法，如酵母双杂交系统，虽然发现了约 13 种 AGR2 的蛋白伙伴，但目前仅验证了其中的 reptin 和 MUC2，而且该方法在非天然环境下进行，可能会产生错误结果。其他方法，如氢 - 氘交换质谱法和基于邻近生物素化与细胞代谢标记相结合的方法，虽然也鉴定出了新的蛋白伙伴，但仍存在一定的局限性。
为了解开这些谜团，来自国内的研究人员开展了一项重要研究。他们将目光聚焦在一种基因编码的光交联剂 DiZPK（3-(3 - 甲基 - 3H - 二氮丙啶 - 3 - 基)- 丙氨基羰基 - Nε-l - 赖氨酸）上。研究人员巧妙地将 DiZPK 引入到 AGR2 的关键结构域，包括二聚化结构域（E60-K64）、硫氧还蛋白样 / CPHS 结构域（C81-S84）和 reptin 结合结构域（F104-Y111）。以乳腺癌 MCF-7 全细胞裂解物作为癌症蛋白质组模型，利用重组突变体 AGR2Q85DiZPK作为诱饵蛋白，成功从细胞 - 细胞黏附通路中捕获到了 AGR2 的新蛋白伙伴。这项研究成果意义重大，为深入理解 AGR2 在细胞黏附、迁移以及癌症转移中的作用机制提供了新的线索，相关研究成果发表在《Bioorganic 》杂志上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是基因编辑技术，通过将特定氨基酸突变为琥珀终止密码子（TAG），并同时引入来自甲烷八叠球菌（Methanosarcina barkeri）的吡咯赖氨酰 - tRNA 合成酶（Pyl - RS）和 tRNAPylCUA，实现了 DiZPK 在 AGR2 特定结构域的基因编码整合；二是光交联技术，利用紫外线（365nm）引发重组突变体 AGR2Q85DiZPK的光交联反应；三是蛋白质纯化与鉴定技术，借助 Ni-NTA 琼脂糖珠或 Ni-NTA 磁性琼脂糖珠对蛋白质进行纯化，通过 LC-MS/MS 技术对捕获到的蛋白伙伴进行鉴定；四是蛋白质相互作用验证技术，采用免疫荧光和分子动力学模拟分析等方法，进一步验证 AGR2 与新发现的蛋白伙伴之间的相互作用。
研究结果
- 捕获新蛋白伙伴：研究人员通过上述一系列实验操作，成功鉴定出了多个参与细胞 - 细胞黏附通路的 AGR2 蛋白伙伴。其中，值得关注的是一些与桥粒（desmosomes）相关的蛋白质，包括 γ - 连环蛋白（γ-catenin）、桥粒芯胶蛋白 - 1（desmocollin - 1，DSC - 1）、桥粒芯糖蛋白 - 1（desmoglein - 1，DSG - 1）、桥粒斑蛋白（desmoplakin，DSP）和斑珠蛋白 - 1（plakophillin - 1，PKP - 1）。这些发现为研究 AGR2 在细胞黏附方面的功能提供了关键线索。
- 验证相互作用：以 γ - 连环蛋白为例，研究人员进行了进一步的蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。通过免疫荧光实验，直观地观察到 AGR2 与 γ - 连环蛋白在细胞内的共定位情况；利用分子动力学模拟分析，从理论层面证实了 AGR2 与 γ - 连环蛋白之间存在直接相互作用。而且，与之前研究中已知能结合并稳定 AGR2 的 β - 连环蛋白相比，在分子动力学研究中，γ - 连环蛋白对 AGR2 表现出了更高的亲和力。这一结果进一步揭示了 AGR2 与 γ - 连环蛋白相互作用的特殊性和重要性。
研究结论与讨论
综上所述，该研究首次将基因编码的光交联剂 DiZPK 引入 AGR2 的三个重要结构域，成功捕获到了来自细胞 - 细胞黏附通路的新蛋白伙伴。这一研究成果具有多方面的重要意义。在基础研究领域，为深入探究 AGR2 在细胞内的功能机制提供了新的方向，有助于揭示其在细胞黏附、迁移以及癌症转移等过程中的具体作用路径。从临床应用角度来看，这些新发现的蛋白伙伴有可能成为潜在的癌症治疗靶点，为开发新型抗癌药物提供了理论依据。此外，该研究还展示了 DiZPK 在捕获微弱和短暂相互作用蛋白方面的优势，为其他蛋白质互作研究提供了新的技术思路和方法借鉴。不过，目前的研究仍存在一些有待进一步探索的地方。例如，虽然鉴定出了这些新的蛋白伙伴，但它们与 AGR2 相互作用的具体分子机制尚未完全明确；这些蛋白伙伴在不同类型癌症中的表达差异以及对癌症预后的影响也需要更多的研究加以验证。未来，研究人员可以针对这些问题开展更深入的研究，有望为癌症的防治带来新的突破。
