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为解决大肠杆菌（E. coli）生产琥珀酸（SA）时对渗透压和低 pH 敏感问题，研究人员开展生物膜工程研究，将psl基因簇导入产 SA 的大肠杆菌，构建固定化发酵系统。结果提高了菌株耐受性和 SA 产量，为大规模生产 SA 提供有效技术平台。
琥珀酸（Succinic acid，SA）作为一种 C4 平台化合物，在食品、医药、塑料等众多领域有着广泛应用，市场前景极为广阔。美国能源部更是将其列为五大最具前景的生物基平台化学品之一。在 2023 年，SA 及其衍生物潜在的年市场规模高达 24.5 万吨，其聚合物市场规模更是达到了 2500 万吨。凭借着生长速度快、营养需求低以及成熟的基因操作工具等优势，大肠杆菌（Escherichia coli ）成为了生产 SA 的常用菌株。在厌氧条件下，过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的大肠杆菌，能够借助还原性三羧酸循环，将一分子二氧化碳固定为一分子 SA，实现较高的产量。例如，利用大肠杆菌 KLPPP 在厌氧条件下，从藻类水解物中生产 SA 的产量可达 0.74 g/g 。
然而，理想很丰满，现实却很骨感。在大规模生产 SA 的过程中，大肠杆菌遇到了 “拦路虎”。它对渗透压和低 pH 环境极为敏感，这严重限制了 SA 的大规模生产。想象一下，在生物反应器这个 “小世界” 里，渗透压和低 pH 就像恶劣的 “气候条件”，让大肠杆菌 “苦不堪言”，无法高效地生产 SA。所以，如何增强大肠杆菌在生物反应器中对恶劣渗透压和 pH 条件的抵抗力，成为了实现高效生物基 SA 生产的关键。
为了攻克这一难题，来自国内多个研究机构的研究人员踏上了探索之旅。他们针对大肠杆菌生产 SA 面临的困境，开展了生物膜工程相关研究。研究人员巧妙地将来自铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的pslA-J基因簇引入到能生产 SA 的大肠杆菌 Suc260 中，这个基因簇可不得了，它负责胞外多糖的合成，就像是给大肠杆菌注入了 “超能力”，能增强生物膜的形成能力。不仅如此，研究人员还把天然psl基因簇的启动子区域替换成了可被廉价无毒的 L - 阿拉伯糖诱导的araC-PBAD启动子，这样就能灵活控制基因的表达。
经过一系列研究，研究人员发现导入pslA-J基因簇的工程菌株 Suc260（pslA-J）表现十分出色。在 5L 生物反应器中，以葡萄糖为底物，它生产的 SA 量达到了 70.54 g/L，比对照组增加了 13.41%。为了进一步提升 SA 的合成效率，研究人员还设计了基于海藻酸钠微球生物膜的细胞固定化发酵系统。最终，在 5L 生物反应器中，以麦秸水解物为底物，在最适 pH 6.8 的条件下，SA 产量达到了 62.66 g/L，产率为 0.76 g/g。当 pH 调低至 6.0 时，SA 产量和产率仍然分别达到了 57.67 g/L 和 0.75 g/g ，相比对照组分别提高了 28.96% 和 42.15%。这一研究成果意义重大，为大规模生产生物基 SA 提供了高效的平台技术，就像是为生物基 SA 的工业化生产开辟了一条 “高速公路”。
在这项研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是基因工程技术，将pslA-J基因簇导入大肠杆菌 Suc260，并替换其启动子区域，精准调控基因表达；其次是生物膜相关检测技术，用于研究工程菌株生物膜形成能力的变化；最后是发酵技术，通过 5L 生物反应器进行发酵实验，优化发酵条件，测定 SA 产量和产率。
下面我们来详细看看研究结果：
- 胞外多糖工程增强大肠杆菌生物膜形成：研究人员首次将来自铜绿假单胞菌的pslA-J基因簇异源导入大肠杆菌，以改善胞外多糖的生物合成，进而提高细菌对恶劣环境的耐受性。为了更好地调控目标基因的表达，选用了PBAD启动子。结果显示，工程菌株 Suc260（pslA-J）生物膜形成能力显著增强，对恶劣环境的耐受性也有所提高。这表明通过导入特定基因簇，能够有效提升大肠杆菌的生物膜形成能力，就像给大肠杆菌穿上了一层坚固的 “铠甲”，使其能更好地抵御外界不良环境。
- 优化发酵条件提高 SA 产量：研究人员构建了基于生物膜的细胞固定化发酵系统，并对发酵条件进行优化。以麦秸水解物为底物，在不同 pH 条件下进行发酵实验。结果发现，在最适 pH 6.8 时，SA 产量和产率达到较高水平；在较低 pH 6.0 时，SA 产量和产率仍显著高于对照组。这说明优化发酵条件和采用细胞固定化发酵系统，能够有效提高 SA 的产量和产率，为大规模生产 SA 提供了更优的方案。
研究结论表明，该研究首次证明了源自铜绿假单胞菌的pslA-J基因簇在增强大肠杆菌胞外多糖合成、提升生物膜形成能力方面的潜力。通过引入可被 L - 阿拉伯糖诱导的PBAD启动子，成功构建了异源基因有效表达系统。此外，基于生物膜的细胞固定化发酵系统进一步提高了 SA 的合成效率。这项研究为生物基 SA 的大规模生产提供了重要的技术支持，有望推动相关产业的发展，让生物基 SA 在更多领域发挥重要作用，为实现可持续发展贡献力量。同时，研究也为其他工业微生物的改造和代谢产物生产提供了新思路和方法，在生命科学和生物技术领域具有重要的参考价值。
