谷氨酸棒杆菌代谢工程改造高效生产L-高丝氨酸的机制研究与应用

本研究针对Corynebacterium glutamicum（谷氨酸棒杆菌）生产L-高丝氨酸（L-homoserine）效率低下的问题，通过代谢工程策略优化底盘菌株：首先敲除thrB基因获得基础菌株HWZ006（产量20.8 g/L）；随后通过同源建模和分子对接鉴定homoserine kinase（HK）关键位点R240，经饱和突变筛选获得最优突变体R240I（产量26.8 g/L）；最终通过外排蛋白Cgl2344优化，使摇瓶产量提升至29.9 g/L（得率0.332 g/g葡萄糖），15 L发酵罐产量达78.3 g/L。该研究首次提出HK酶活调控替代thrB敲除的新策略，为L-天冬氨酸族氨基酸衍生物生产提供高效底盘。

　　

L-高丝氨酸作为L-天冬氨酸族氨基酸合成的关键前体，在化妆品、食品和医药领域具有广泛应用。然而，传统生产菌株Corynebacterium glutamicum的产量远低于Escherichia coli（最高125.07 g/L），且存在thrB基因敲除导致的生长缺陷、外排系统效率低下等问题。针对这些瓶颈，中国的研究团队通过多维度代谢工程改造，实现了C. glutamicum高效生产L-高丝氨酸的技术突破。

研究采用基因编辑（pK18mobrpsL介导的基因敲除）、分子对接（Discovery Studio软件分析HK结合位点）、饱和突变（R240位点19种变体筛选）和发酵优化（15 L罐分批补料）等关键技术。通过分析L-苏氨酸生产菌TWZ023的代谢网络，发现thrB敲除株HWZ006虽能积累L-高丝氨酸，但存在生长抑制。研究创新性地转向HK酶活调控，发现R240位点与底物结合的关键作用，最优突变体R240I使摇瓶产量提升28.8%。进一步通过质粒pXTuf过表达外排蛋白Cgl2344，最终菌株在规模化发酵中展现出78.3 g/L的工业级产量。

工程化代谢流向L-高丝氨酸生产
通过比较L-苏氨酸生产菌WM001与thrB敲除株HWZ006的代谢差异，证实直接阻断下游路径虽能积累L-高丝氨酸（20.8 g/L），但会消耗大量ATP并影响菌体生长。

HK的分子改造与机制解析
序列比对发现HK的R240在进化中高度保守。分子对接显示该残基通过盐桥与L-高丝氨酸的羧基结合，突变后（如R240I）可降低结合亲和力，使代谢流更多导向L-高丝氨酸积累。

外排系统优化
筛选发现染色体编码的Cgl2344蛋白比传统外排蛋白rhtB更高效，过表达后胞外L-高丝氨酸浓度提升11.6%，且未引起明显的代谢负担。

该研究首次在C. glutamicum中实现HK功能调控替代基因敲除，通过"酶活微调-外排强化"的双轨策略，使产量达到目前报道的最高水平（78.3 g/L）。不仅解决了thrB完全失活导致的生长缺陷问题，其发现的HK关键位点R240更为其他氨基酸激酶的改造提供理论依据。研究成果发表于《Bioresource Technology》，为L-甲硫氨酸等衍生物的绿色制造奠定基础。作者Zhao Guihong等强调，未来可通过动态调控系统（如P_fliA启动子）进一步平衡生长与生产的关系。