基于一锅法RPA-CRISPR/Cas12a的电化学侧流双模式传感平台超灵敏精准检测沙门氏菌

为解决食源性病原体快速筛查难题，研究人员开发了一锅法RPA-CRISPR/Cas12a整合电化学侧流条（OPRCC-eLFS），实现沙门氏菌双模式检测。该技术突破传统方法需分步操作的限制，电化学检测限达3.84 CFU/mL，可视化检测限384 CFU/mL，兼具高灵敏度与抗气溶胶污染特性，为食品安全监测提供创新工具。

　　

论文解读

在全球公共卫生领域，沙门氏菌引发的食源性疾病每年导致超6亿病例和42万死亡，其环境耐受性与快速增殖特性使其成为食品安全监测的重点靶标。传统检测方法如平板培养、PCR等存在耗时长、设备依赖性强等缺陷，而现有CRISPR技术虽具高特异性，却因需预扩增步骤导致操作复杂化。更棘手的是，常规RPA-CRISPR/Cas12a体系因Cas12a蛋白的随机反式切割（trans-cleavage）活性会非特异性降解引物与扩增产物，迫使研究人员采用物理隔离或亚优化PAM序列等折中方案，这些方法或牺牲灵敏度或增加操作复杂度。

针对上述瓶颈，中国研究人员创新性构建了OPRCC-eLFS系统。该平台通过精密优化RPA引物与CRISPR组分，首次实现真正意义上的"一锅法"反应——在单管中同步完成核酸扩增与CRISPR检测，彻底规避开管操作引发的交叉污染风险。研究团队巧妙利用金纳米颗粒（AuNPs）的双重功能：既作为比色信号标记物，又催化[Fe(CN)₆]^3-/NH₃-BH₃氧化还原反应，通过电化学信号放大将检测灵敏度提升两个数量级。

关键技术方法
研究采用重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a协同体系，通过引物设计与反应条件优化实现单管反应平衡；构建双模式侧流条，集成比色读条与电化学传感模块；利用AuNPs催化氧化还原反应增强信号；在牛奶、鸡蛋等实际样本中验证性能。

研究结果
设计原理
OPRCC-eLFS通过优化RPA引物长度（35-45 bp）及Mg²⁺浓度（12 mM），使扩增效率与Cas12a切割活性达到动态平衡。当靶标存在时，RPA扩增产物激活Cas12a的反式切割活性，释放生物素标记的ssDNA报告分子，触发侧流条上AuNPs探针的双信号响应。

性能验证
电化学模式检测限低至3.84 CFU/mL，较比色模式（384 CFU/mL）敏感100倍。在加标牛奶样本中回收率达92.3-107.8%，且与李斯特菌等近缘种无交叉反应，证实其高特异性。

实际应用
在205份市售食品检测中，与国标方法符合率98.5%，全程检测时间<40分钟，显著优于传统培养法（72小时）。

结论与意义
该研究突破了一锅法CRISPR检测的技术壁垒，首创将电化学定量与比色筛查融于侧流平台。其3.84 CFU/mL的灵敏度满足国际食品法典委员会（CAC）对沙门氏菌"零容忍"标准，双模式设计既适合现场快速筛查又可实验室精准定量。尤为重要的是，封闭式操作杜绝气溶胶污染风险，为POCT（床旁检测）设备开发提供新范式。论文发表于《Biosensors and Bioelectronics》，标志着食品安全检测领域向超灵敏、智能化方向迈出关键一步。