新发现！牛遗传性球形红细胞增多症中带 3 - 锚蛋白 - 血影蛋白连接调控红细胞形态的关键作用

为探究带 3 - 锚蛋白 - 血影蛋白（band 3–ankyrin–spectrin）连接对红细胞形态的调控机制及对牛遗传性球形红细胞增多症（HS）临床严重程度的影响，研究人员开展相关研究。结果发现 α- 血影蛋白 E91K 突变影响血影蛋白四聚体形成，该连接对维持红细胞膜稳定性意义重大。

　　在奇妙的人体微观世界里，红细胞如同忙碌的 “快递员”，在血管中一刻不停地穿梭，为身体各个组织器官输送氧气。为了能在复杂的血液循环系统中持续工作超 100 天，红细胞必须具备高度的柔韧性和耐久性，就像拥有 “超能力” 一样，能在承受各种剪切应力的情况下，不断发生可逆变形，还不会出现破碎或膜表面积丢失的情况。

红细胞的这种 “超能力” 源于其独特的结构组成，膜骨架蛋白、跨膜蛋白和脂质双分子层共同协作，维持着红细胞的变形能力和稳定性。其中，血影蛋白（spectrin）、肌动蛋白（actin）和蛋白 4.1R 等是膜骨架网络的主要成分，它们相互连接，如同搭建起一座坚固的 “桥梁”，支撑着红细胞的结构完整性。而带 3 蛋白（band 3）与血影蛋白之间通过锚蛋白（ankyrin）相连，这一连接不仅稳定了脂质双分子层，还对血影蛋白四聚体的形成起着重要作用。

然而，长期以来，虽然科学家们推测脂质双分子层 - 膜骨架连接在稳定血影蛋白骨架方面有重要作用，但一直缺乏自然发生的病例来证实这一假设。同时，在一些红细胞相关疾病，如遗传性椭圆形红细胞增多症（HE）和遗传性球形红细胞增多症（HS）中，由于这些相互作用存在缺陷，导致红细胞膜出现异常，引发溶血贫血等问题。其中，HS 的主要特征是垂直相互作用减弱，使得脂质双分子层因缺乏膜骨架的支撑而不稳定，进而释放无骨架囊泡，最终导致红细胞变成球形。此前研究还发现，牛红细胞中由于 SLC4A1 基因的提前终止突变导致带 3 蛋白完全缺失，会使带 3 - 锚蛋白 - 血影蛋白连接丧失，引起严重的球形红细胞增多症，但牛和小鼠、人类的带 3 蛋白缺陷红细胞膜病理存在显著差异。这些问题都亟待解决，于是，来自北海道大学兽医学院（Veterinary School of Hokkaido University）的研究人员开启了他们的探索之旅。

研究人员对携带 SLC4A1 基因 R664X 突变的带 3 蛋白缺陷日本黑牛以及健康对照牛展开研究。他们运用了多种关键技术方法，包括对牛的血液样本进行常规血液学参数检测，使用扫描电子显微镜和相差显微镜对红细胞进行形态学分析，采用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）和免疫印迹法分析红细胞膜蛋白，通过诱导红细胞形成囊泡并对其进行相关检测，以及运用 ektacytometry 技术测量红细胞膜的机械性能等。同时，他们还对大量牛的样本进行了基因分型和相关分析。

研究结果主要分为以下几个方面：

1. 两种不同的红细胞表型：研究发现带 3 蛋白缺陷的牛可分为两种类型，即 1 型和 2 型。1 型红细胞在常温下孵育数小时后，约 70% 会出现明显的泡状突起和 protrusions ，且膜骨架蛋白如血影蛋白、4.1R 和肌动蛋白显著减少；2 型红细胞则无明显的自发碎片化现象，膜骨架蛋白含量与对照组相似。这表明 2 型红细胞代表了带 3 蛋白缺陷的主要表型，即膜表面积丢失但膜骨架成分无显著减少，而 1 型红细胞的显著脆性是由带 3 蛋白缺陷和其他额外缺陷共同导致的复合表型。
2. E91K 替换的影响：通过对 α - 血影蛋白基因（SPTA1）的分析，研究人员发现 1 型带 3 蛋白缺陷的牛中存在一种新的 E91K 替换突变。携带该突变的个体贫血症状更严重，红细胞膜中血影蛋白含量降低约 15%，膜机械稳定性明显下降。尽管在体外非生理高剪切力下红细胞膜不稳定，但在生理条件下，这些个体的红细胞形态和指标无明显异常，说明 E91K 替换导致的膜成分碎片化和丢失在体内循环中进展缓慢。
3. α₁重复结构的改变：进一步研究发现，E91K 替换使 α₁重复结构发生改变，导致其 α - 螺旋含量降低，热稳定性下降，结构变得无序。通过圆二色谱（CD）、核磁共振（NMR）等技术分析，发现 E91K 替换引起了 α₁结构域的展开和 α - 螺旋束的解旋。
4. 对血影蛋白四聚体形成的影响：E91K 替换会减少血影蛋白四聚体的形成，使含有 E91K 突变的迷你血影蛋白（mini - SpK91）形成的四聚体相对丰度明显低于正常的迷你血影蛋白（mini - SpE91）。而且，当用 DIDS 处理红细胞以破坏带 3 - 锚蛋白连接时，携带 E91K 突变的红细胞（E/K）会释放出含有血影蛋白和 4.1R 的囊泡，表明膜骨架发生了局部碎片化。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，E91K 替换导致的血影蛋白四聚体形成减弱，显著加剧了带 3 蛋白缺陷引起的球形红细胞表型。1 型带 3 蛋白缺陷且携带 E91K 替换的红细胞，其 HS 表型是由带 3 蛋白缺失导致的膜表面积减少和血影蛋白自组装受损引起的膜碎片化共同造成的，这说明 E91K 替换是一种新的 SPTA1 等位基因特异性膜缺陷调节因子。同时，研究还发现，虽然 E/K 和 K/K 红细胞的血影蛋白四聚体化减少，但在正常带 3 蛋白含量的情况下，它们并没有表现出明显的血液学病变，这暗示这些红细胞可能存在某种机制来限制血影蛋白四聚体化改变带来的损伤。此外，研究人员还深入探讨了 E91K 替换影响血影蛋白四聚体形成的机制，发现其与其他遗传性椭圆形红细胞增多症相关突变导致血影蛋白四聚体形成减少的机制不同。

总的来说，这项研究通过对牛自然发生的 E91K 替换病例的研究，结合带 3 蛋白缺陷相关的 SLC4A1 基因突变，证实了带 3 - 锚蛋白 - 血影蛋白连接在维持红细胞膜机械性能方面的重要作用，除了其已被熟知的稳定膜脂质双分子层的功能外，还对血影蛋白四聚体的形成和维持膜骨架的稳定性至关重要。这一研究成果发表在《Blood Red Cells 》上，为深入理解红细胞膜疾病的发病机制提供了新的视角，也为相关疾病的诊断和治疗提供了潜在的靶点和理论依据。