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(R)-3 - 羟基脂肪酸（R-3HAs）在多领域意义重大，但中链长度（mcl）的 R-3HAs 工业化生产困难。研究人员以铜绿假单胞菌 PAO1 为对象，改造其鼠李糖脂合成途径生产 mcl R-3HA 单体。最终获得 18g/L 的 HAAs，水解得到纯度 95% 的 (R)-3 - 羟基癸酸（R-3HD），为 R-3HAs 生产提供新途径。
在生物制造领域，(R)-3 - 羟基脂肪酸（R-3HAs）可是 “潜力股”。它在制药、食品添加剂等众多行业都有着关键作用，是合成各种高价值化合物的重要原料。想象一下，它能参与合成药物，对抗疾病；还能作为食品添加剂，保障食品的品质和安全。然而，现实却给科研人员出了道难题。目前，实现中链长度（mcl）的 R-3HAs 工业化生产困难重重，主要是缺乏合适的菌株和高效的生物合成途径。就像在寻找宝藏的路上，找不到正确的地图和工具，难以抵达目的地。为了解决这个棘手的问题，中国科学院微生物研究所的研究人员开启了一场探索之旅，相关研究成果发表在《AMB Express》上。
研究人员的主要目标是利用 R-3-(R-3 - 羟基烷酰氧基) 烷酸（HAAs）这个 “原料库” 来生产 mcl R-3HA 单体。HAAs 是鼠李糖脂（RLs）的前体，结构比常见的聚羟基脂肪酸酯（PHA）简单。研究人员认为利用它或许能降低成本、提高产量和生产操作性，为 mcl R-3HAs 的商业化生产带来新希望。
为开展研究，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因敲除技术，通过敲除目标基因，构建突变菌株。比如敲除铜绿假单胞菌 PAO1 中 rhlB 和 rhlC 等基因，截断鼠李糖脂合成途径。其次是利用薄层层析（TLC）和气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）技术，对产物进行分离、鉴定和纯度分析。
在研究结果方面：
- 代谢工程策略生产 HAAs：研究人员对铜绿假单胞菌 PAO1 的鼠李糖脂生物合成途径进行改造，敲除 rhlB、rhlC 和 rhlA 等基因。结果发现，敲除 rhlC 后，产物只有单鼠李糖脂；敲除 rhlB 后，鼠李糖脂消失，出现新物质 HAAs；敲除 rhlA 和 rhlB 后，产物几乎检测不到。在 PAO1-ΔBC 菌株的上清液中，能检测到大量 HAAs（约 11g/L，产率为 18.3% g/g 植物油） 。这表明基因敲除对鼠李糖脂和 HAAs 的生产影响显著，为后续研究奠定了基础。
- 提高 HAAs 产量：
- 碳源的影响：研究人员考察不同碳源对 HAAs 产量的影响，发现以棕榈油为碳源时，PAO1-ΔBC 菌株生长更好，HAAs 产量最高可达 12g/L，产率为 20% g/g 植物油 ，而甘油和葡萄糖作为碳源时产量较低。进一步研究棕榈油浓度对 HAAs 产量的影响，发现 45g/L 棕榈油时产量最高。这说明碳源的选择和浓度对 HAAs 生产至关重要。
- β 氧化途径工程改造：由于 β 氧化途径在 HAAs 生产中起重要作用，研究人员敲除 β 氧化途径中的关键酶基因，如 fadBA1、fadBA4、fadD2 和 fadD4 等。结果显示，虽然对细菌生长有一定影响，但 HAAs 产量逐渐增加。其中，PA-A3-ΔD2 菌株的 HAAs 产量最高，达到 18g/L，产率为 30% g/g 植物油，体积生产力为 0.19g/L/h ，相比初始菌株 PAO1-ΔBC 有显著提高。
- HAAs 碱性水解生产 R-3HAs：研究人员对积累的 HAAs 进行碱性水解，使其酯键断裂生成 R-3HA 单体。经 TLC 和 GC-MS 分析，发现水解产物主要是 (R)-3 - 羟基癸酸（R-3HD），纯度约 95% 。研究还考察了水解时间、温度、NaOH 浓度和 HAAs 浓度等因素对水解效率的影响，发现碱性浓度、温度和处理时间直接影响 HAAs 水解效率，浓度越高，水解所需时间越长。例如，60g/L HAA 在 80℃、0.5mol/L NaOH 条件下，完全水解成单体需要 2.5h 。与 PHA 解聚水解法相比，HAA 碱性水解更简单快速。
- R-3HD 耐受性测定：R-3HD 具有抗菌性，研究人员测试 PAO1 对 R-3HD 的耐受性。结果发现，在 LB 培养基中，R-3HD 浓度达到 2.5g/L 及以上时抑制菌株生长；在 MSM - 棕榈油培养基中，浓度达到 5.0g/L 及以上时出现抑制作用。这表明 R-3HD 的抗菌性会对 mcl R-3HA 单体的积累造成挑战。
研究结论和讨论部分指出，该研究提出利用 HAAs 替代 PHA 作为底物库生产 mcl R-3HAs 的新方法。HAAs 来源丰富多样，从不同菌株中筛选出的 RhlA 能合成多种 HAAs。与 PHA 降解法相比，HAAs 水解生产 R-3HAs 的方法更具优势，成本效益更高、操作更简单高效。然而，mcl R-3HAs 的抗菌性仍是其大量积累的阻碍，积累 HAAs 二聚体而非 R-3HA 单体可有效解决这一问题。总体而言，该研究为 mcl R-3HAs 的生产提供了新的思路和方法，“HAAs 库” 方法潜力巨大，值得进一步深入研究，有望为相关产业的发展带来新的突破，在生物制造领域开拓出更广阔的天地。
