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为探究 roraa 基因在斑马鱼昼夜节律和代谢调控中的作用，研究人员构建突变体和转基因鱼，经多实验方法发现，Roraa 通过 RORE 元件调控 per2 表达，影响代谢通路，该成果为代谢疾病治疗提供新靶点。
在奇妙的生命世界里，昼夜节律如同一个精准的时钟，掌控着生物体的各项生理活动。从植物的光合作用到动物的作息规律，都离不开这个 “生物钟” 的调节。一旦昼夜节律出现紊乱，就像时钟走偏了，各种代谢疾病，如肥胖、糖尿病等，可能就会找上门来。
RORα（retinoic acid receptor-related orphan receptor α，维甲酸相关孤儿受体 α）作为调节昼夜节律和代谢过程的重要角色，在小鼠等生物中的研究已取得一定成果，但在斑马鱼中，它的具体作用机制还是一个未解之谜。斑马鱼因其独特的优势，如胚胎透明便于观察、生命周期短、繁殖能力强，且与哺乳动物基因组相似度高，成为研究昼夜节律和基因功能的理想模型。为了深入了解 RORα 在斑马鱼中的作用，苏州大学苏州医学院的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》杂志上。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：利用 CRISPR/Cas9 系统构建斑马鱼 roraa 基因敲除（roraa-/-）突变体；借助 Tol2kit 转基因系统构建过表达 Roraa 的转基因斑马鱼；运用定量 PCR（qRT-PCR）和原位杂交技术检测基因表达；通过双荧光素酶报告基因检测分析基因调控；进行转录组测序探究基因表达变化。
1. roraa 基因的节律性表达及调控机制
研究人员首先对斑马鱼 roraa 基因的表达节律产生了浓厚兴趣。他们在持续黑暗（DD）和光照 - 黑暗（LD）条件下，对野生型斑马鱼进行研究。通过 qRT-PCR 技术检测发现，roraa 基因的表达呈现出显著的昼夜节律性，白天表达量高，夜晚表达量低。为了进一步验证，他们开展原位杂交实验，结果也证实了这一现象。
随后，研究人员深入探索 roraa 基因启动子区域潜在的调控元件。利用 JASPAR 数据库预测，发现该启动子区域存在两个 D-box 元件、两个 E-box 元件和一个 RORE（RAR-related orphan receptor response element，维甲酸相关孤儿受体反应元件）。功能验证实验表明，Bmal1b 和 Clock1a 形成的异二聚体，以及 Tefa 等，都能激活 roraa 基因的表达，其中 E-box 元件在这一调控过程中起着关键作用。这一系列研究清晰地揭示了 roraa 基因的节律性表达是由核心昼夜节律时钟精确调控的，特别是 Bmal1b 和 Clock1a 异二聚体直接作用于启动子中的 E-box 元件来实现调控。
2. roraa 基因敲除对斑马鱼的影响
为了更深入了解 RORα 的功能，研究人员成功构建了 roraa-/-突变体斑马鱼。在构建过程中，他们仔细设计引物，合成 gRNA 并与 Cas9 mRNA 共注射到斑马鱼单细胞期胚胎中。经过筛选，获得了稳定的 F2 纯合突变体，用于后续实验。
对突变体斑马鱼的行为分析发现，在 LD 条件下，roraa-/-突变体斑马鱼幼鱼白天的平均游泳距离明显低于野生型，活动量大幅减少；在 DD 条件下，虽然活动周期与野生型差异不显著，但活动相位延迟了约 2 小时，且活动幅度仅为野生型的三分之一左右，这表明其昼夜行为表型发生了显著改变。
进一步探究其分子机制，研究人员通过 qRT-PCR 分析斑马鱼幼鱼核心时钟基因的表达变化。结果显示，在 LD 和 DD 条件下，bmal1b、clock1a、cry1aa 和 per2 等核心时钟基因的表达水平均显著下降，这说明 roraa 基因敲除导致斑马鱼核心时钟基因表达改变，进而影响了其昼夜行为节律。
3. Roraa 对 per2 基因的调控作用
在 roraa-/-突变体中，研究人员观察到一些核心时钟基因表达降低，这让他们推测 Roraa 可能在这些基因的转录调控中发挥重要作用。以 per2 基因为研究对象，他们发现 per2 启动子中存在保守的 RORE。
通过将 per2 - luc 报告质粒与 Roraa 表达质粒共转染细胞，发现 Roraa 能以剂量依赖的方式显著激活 per2 转录，随着 Roraa 表达量增加，per2 - luc 报告基因表达也逐渐增加。为了确定 RORE 元件的作用，研究人员构建了缺失 RORE 元件的 per2 启动子突变体，实验结果表明，缺失 RORE 元件后，Roraa 对 per2 - luc 的激活作用明显消失。此外，用 RORα 抑制剂 SR3335 和激活剂 SR1078 处理斑马鱼幼鱼，结果也与上述实验一致，这充分证实了 Roraa 可以通过 per2 启动子中的 RORE 元件直接调控其转录，进而影响 per2 基因的表达。
4. Roraa 过表达对斑马鱼的影响
为了进一步验证 Roraa 的调控作用，研究人员构建了热休克诱导过表达 Roraa 的转基因斑马鱼。行为测试结果显示，过表达 Roraa 显著增加了转基因幼鱼的活动量，并使其活动相位提前，这与 roraa-/-突变体的行为表型相反，再次证明了 Roraa 在调节斑马鱼行为节律中的重要性。
对转基因幼鱼时钟基因表达水平的分析表明，与野生型相比，过表达 Roraa 显著上调了大多数时钟基因的表达，包括 per2 基因，其表达趋势与 roraa-/-突变体中的情况相反。这表明 Roraa 过表达不仅能够调节斑马鱼的行为节律，还会影响时钟基因的表达，进一步支持了 Roraa 在调节斑马鱼行为节律中的关键作用。
5. roraa 基因表达异常对斑马鱼的影响及 Roraa 在脂质代谢中的作用
研究人员对野生型和 roraa-/-突变体斑马鱼进行转录组分析，发现 2535 个基因仅在野生型中表现出节律性，1748 个基因仅在突变体中表现出节律性，617 个基因在两者中均有节律性。进一步对失去节律性的基因进行分析，发现 pentose phosphate pathway（戊糖磷酸途径）、peroxisomes（过氧化物酶体）、arginine and proline metabolism（精氨酸和脯氨酸代谢）、amino acid biosynthesis（氨基酸生物合成），尤其是 PPAR（peroxisome proliferator-activated receptor，过氧化物酶体增殖物激活受体）信号通路和脂肪酸代谢等途径在 roraa-/-突变体中发生了改变。
为了深入探究 Roraa 在 PPAR 信号通路中的调控作用，研究人员对通路中的关键基因进行定量分析。结果发现，在 roraa-/-突变体中，cpt2（肉碱棕榈酰转移酶 2）和 fabp2（脂肪酸结合蛋白 2）基因的表达下降，me1 基因表达主要上升，在 DD 条件下 fads2 基因表达显著下降。体外细胞实验也表明，Roraa 能显著调节 cpt2、fabp2、me1 和 fads2 基因的表达，且对 fabp2 的调节是通过 RORE 元件介导的。这一系列研究表明，Roraa 通过调节 PPAR 信号通路中的关键基因，对脂质代谢产生重要影响。
研究结论表明，Roraa 基因在斑马鱼昼夜节律和代谢过程中发挥着至关重要的作用。它通过 RORE 元件直接影响 per2 基因的表达，在昼夜节律调控机制中占据关键地位。同时，Roraa 基因的缺失会改变代谢通路，尤其是脂质代谢和 PPAR 信号通路，这对于维持代谢稳态意义重大。
这项研究不仅丰富了人们对昼夜节律和代谢调控机制的认识，还为治疗与昼夜节律紊乱相关的代谢疾病提供了新的潜在靶点和理论依据，为后续相关研究指明了方向，推动了生命科学和健康医学领域的发展。
