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为探究 miRNAs 在落叶松干旱胁迫下的作用机制，东北林业大学研究人员以落叶松胚性愈伤组织为材料，研究 Lol-miR11467 的功能。结果发现其过表达会降低细胞系抗旱性。该研究为提高植物抗逆性提供理论依据。
在广袤的森林中，落叶松（Larix gmelinii (Rupr.) Kuzen.）作为我国北方重要的木材和生态树种，一直发挥着关键作用。经过漫长的传统育种，人们获得了不少优良的落叶松种质资源。然而，传统育种面临诸多挑战，比如种子园种子产量低、结实周期长，且有性繁殖会导致优良性状的遗传分离和变异。同时，像扦插、嫁接等传统无性繁殖方式，生根率低，难以在短期内大规模生产。
在植物生长发育过程中，微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一类非编码的单链小 RNA，它们虽 “身材娇小”，却在调控植物生长和抗逆性方面有着巨大能量，特别是在应对干旱胁迫时。但目前关于落叶松在干旱胁迫下 miRNAs 的研究还处于起步阶段。为了填补这一知识空白，深入了解落叶松应对干旱的分子机制，东北林业大学的研究人员开展了一项极具意义的研究，相关成果发表在《BMC Plant Biology》杂志上。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用农杆菌介导法将 Lol-miR11467 导入落叶松胚性愈伤组织，实现基因的转化；二是借助转录组测序技术，全面分析基因表达的变化情况；三是采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）对测序数据进行验证，确保研究结果的可靠性。
下面让我们来详细看看研究结果：
- 构建过表达载体 pCAMBIA1301-Lol-miR11467：研究人员成功克隆了 Lol-miR11467 基因，并将其构建到载体 pCAMBIA1301 上，经过一系列检测，证实载体构建成功，且能用于后续对胚性愈伤组织的侵染。
- 获得并检测 pCAMBIA1301-Lol-miR11467 愈伤组织：通过遗传转化，研究人员得到了含有目标基因的愈伤组织。经 PCR 检测，Lol-miR11467 已成功整合到落叶松基因组中。qRT-PCR 结果显示，转基因细胞系中 Lol-miR11467 的相对表达水平显著高于对照组。
- 转基因愈伤组织在 PEG 渗透胁迫下的生长和形态变化：在聚乙二醇（PEG）渗透胁迫下，与野生型相比，转基因愈伤组织的鲜重随胁迫时间延长而持续下降，且增殖能力较弱。这表明过表达 Lol-miR11467 可能对愈伤组织在干旱条件下的生长产生不利影响。
- 转基因愈伤组织在 PEG 渗透胁迫下抗氧化酶活性的测定：在 PEG6000胁迫下，转基因细胞系 OE3 和 OE12 中过氧化物酶（POD）活性低于野生型，而丙二醛（MDA）含量高于野生型。此外，可溶性蛋白和可溶性糖含量也低于野生型。这些结果说明过表达 Lol-miR11467 会削弱转基因细胞系的抗氧化能力和渗透调节能力，进而降低其抗旱性。
- 差异表达基因（DEGs）的鉴定：对转基因细胞系和对照组进行转录组测序分析，筛选出大量差异表达基因。主成分分析（PCA）显示样本间存在差异且相关性良好，表明 RNA 测序数据质量可靠。进一步分析发现，Lol-miR11467 可能负调控一些差异表达基因，影响落叶松的生长发育。
- RNA-seq 数据的验证：选取 15 个差异表达基因进行 qRT-PCR 验证，结果表明虽然两种检测方法得到的基因表达水平有所不同，但表达趋势一致，证明 RNA-seq 数据可靠，可用于后续基因功能分析。
- DEGs 的聚类表达和注释分析：绘制差异表达基因的聚类热图发现，过表达 Lol-miR11467 对其靶基因具有负调控作用，扰乱了落叶松正常的转录水平。许多注释的差异表达基因在针叶树中功能未知，还需进一步研究。
- DEGs 的功能富集分析：通过基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，发现过表达 Lol-miR11467 影响了多个代谢途径，其中苯丙烷生物合成途径在两组比较中均显著富集，表明 Lol-miR11467 在该途径中发挥重要作用。
- 转基因细胞系中参与干旱响应的基因下调：分析发现，许多与干旱响应相关的基因，如转录因子、氧化还原酶、植物激素信号转导相关基因以及参与渗透调节的基因在转基因细胞系中均下调，这进一步证实过表达 Lol-miR11467 会降低转基因细胞系的抗旱性。
- Lol-miR11467 靶基因的预测：预测了 Lol-miR11467 的 4 个潜在靶基因，经 qRT-PCR 分析，发现转基因细胞系中这些靶基因的表达水平显著下降，表明 Lol-miR11467 可能通过负调控这些靶基因发挥作用。
综合研究结果和讨论部分，我们可以得出以下结论：过表达 Lol-miR11467 会抑制 PEG 胁迫下愈伤组织的生长，降低抗氧化酶活性，下调与苯丙烷代谢、转录因子、氧化还原酶、植物激素信号转导和葡萄糖代谢相关的基因表达，进而削弱落叶松细胞系的抗旱性。这项研究为深入理解 miRNAs 在落叶松应对 PEG 渗透胁迫中的分子机制提供了重要参考，有助于推动提高植物对环境胁迫适应性策略的发展，为未来的林业育种和生态保护工作奠定了坚实的理论基础。
