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这篇论文聚焦 HIV 研究。通过对感染猴免疫缺陷病毒（SIV）的猕猴研究，发现 SIV 前病毒在感染后期会潜伏于短寿命 CD4+T 细胞中，前病毒的遗传差异和整合时间呈双相下降，为理解 HIV 潜伏库形成机制提供新视角，对攻克 HIV 感染意义重大。
研究背景
自 1981 年艾滋病流行以来，人类免疫缺陷病毒（HIV）已感染超 8400 万人，造成约 4010 万人死亡。抗逆转录病毒疗法（ART）虽能抑制 HIV 复制、降低病毒载量并延长生命，但 HIV 可作为整合 DNA（前病毒）潜伏在静息 CD4+T 细胞中，形成转录沉默的病毒库。该病毒库在 ART 治疗中断时可重新引发感染，是 HIV 治愈的主要障碍。目前，对于感染细胞如何存活、持续存在并最终进入长期病毒库，以及潜伏库何时建立等问题，研究结果存在矛盾。部分研究表明，即使在感染后数天内启动 ART，治疗中断时仍会出现病毒反弹，提示潜伏库快速连续播种；而另一些研究发现，病毒反弹序列与初始感染病毒更接近，或潜伏库在感染早期已基本建立。此外，关于 T 细胞在潜伏库中的命运也存在争议，有研究认为是长期感染的 T 细胞持续存在和克隆扩增维持了潜伏库，而非病毒持续复制。本研究旨在通过对感染 SIV 的猕猴进行研究，进一步探究潜伏库的组成和动态变化机制。
研究方法
- 实验动物与样本处理：选用 10 只印度起源的恒河猴，经直肠感染 SIVmac251毒株，感染约 48 周后开始接受 ART 治疗，药物为替诺福韦二代富马酸酯、恩曲他滨和多替拉韦（TDF/FTC/DTG）。定期采集外周血，分离外周血单个核细胞（PBMCs），从中纯化 CD4+T 细胞，提取 DNA，采用完整前病毒 DNA 检测法（IPDA）和单基因组测序技术对包膜基因（env）进行检测，去除有缺陷的序列。
- 数据分析方法
- 计算遗传差异：将非缺陷型前病毒 env 序列与参考序列比对，计算遗传差异（divergence），参考序列包括 SIVmac251毒株的共识序列、毒株中的每个序列以及感染后首次检测到的序列等。通过特定公式计算差异值，并使用 R 语言中的线性模型拟合差异曲线，确定曲线斜率变化的拐点。
- 估计 CD4+T 细胞半衰期：对 IPDA 测量的完整前病毒 SIV DNA 数据拟合双相指数衰减模型，分别采用混合效应模型（将所有猕猴数据合并分析并调整个体差异）和单独分析每只猕猴数据的方法，估计短寿命和长寿命 CD4+T 细胞的半衰期。
- 系统发育估计整合时间：使用 IQ-Tree 构建系统发育树，将树的根定在感染确诊后第一个时间点的序列的最近共同祖先。通过线性回归，将治疗前血浆 RNA env 序列的采样时间与根到 tip 的距离相关联，进而根据该关系估计治疗后序列的整合时间。
- 估计初始差异分布：假设治疗开始时的序列来自短寿命和长寿命细胞的混合，而最后一个时间点的序列仅来自长寿命细胞。通过对最后一个时间点序列的突变分布进行缩放和调整，估计长寿命细胞在治疗开始时的突变分布，再用治疗开始时的总突变分布减去长寿命细胞的突变分布，得到短寿命细胞的突变分布。
- 构建差异动力学模型：基于短寿命和长寿命细胞中不同的初始突变分布以及治疗开始后细胞的动态变化，构建序列差异动力学模型。假设无新的细胞感染和细胞增殖，在每个时间步长内，细胞按各自的衰减率随机衰减，根据公式计算存活细胞的差异。
研究结果
- 早期 ART 期间前病毒 SIV 的差异和整合时间双相下降：研究发现，非缺陷型前病毒 env 序列的差异随时间呈双相下降，第一阶段下降速度约为第二阶段的 230 倍。猕猴个体间差异曲线拐点时间存在较大差异，平均为 11.6 周，范围为 4 - 28 周。通过两种方法重新估计 CD4+T 细胞半衰期，结果显示短寿命细胞半衰期范围为 0.9 - 19.8 天，长寿命细胞为 3.9 - 12.2 个月，且两种方法均估计 ART 开始时短寿命细胞的比例为 0.6。此外，血浆 env RNA 序列在 ART 开始时比前病毒 env 序列更具差异，当使用血浆 env RNA 序列计算差异动力学时，第一阶段差异下降速度更快，约为第二阶段的 390 倍。通过系统发育分析估计的整合时间与差异变化趋势几乎相同，也呈双相下降，表明 ART 开始后存活的 SIV 感染的 CD4+T 细胞群体是动态变化的，早期主要是靠近 ART 开始时沉积的前病毒，随着时间推移，较老的前病毒相对更占优势。
- 短寿命和长寿命 CD4+T 细胞亚群包含具有不同差异的前病毒：开发新的计算方法区分短寿命和长寿命细胞中前病毒的突变分布，结果表明，在 ART 开始时，短寿命细胞中的前病毒平均比长寿命细胞中的前病毒更具差异。这意味着短寿命细胞中的病毒在感染后期更接近 ART 开始时整合，而长寿命细胞中的病毒在感染早期整合。同时，短寿命细胞和长寿命细胞中突变数量的分布相对于总体差异中位数存在偏移，短寿命细胞向右偏移（更多突变），长寿命细胞向左偏移（更少突变），进一步支持了两个细胞亚群代表不同病毒沉积时期的结论。与血浆 RNA 群体相比，血浆 RNA 群体在 ART 开始时更具差异，对应最新的病毒变体。
- 具有不同差异的短寿命和长寿命 CD4+T 细胞的衰减解释了双相差异下降：构建的模型模拟结果显示，整体差异动力学与实验观察到的差异下降趋势相符。无论使用哪种半衰期估计方法，模型都能捕捉到猕猴间的异质性，且模拟结果与实验数据的变异性相似。当用血浆病毒 RNA 序列替代 ART 开始时的前病毒 env DNA 序列，模型结果仍与实验观察一致，表明短寿命和长寿命 CD4+T 细胞中前病毒的差异能够解释观察到的双相差异下降现象。
- 差异下降结果对参数和突变谱的扰动具有稳健性：研究模型参数对差异随时间变化的相对贡献和敏感性，发现 ART 开始时，平均前病毒差异和初始短寿命细胞频率对差异的贡献较大，随着时间推移，长寿命细胞中的平均前病毒差异逐渐成为决定差异的主要因素。模拟不同的突变谱组合发现，只要短寿命细胞中的平均差异大于长寿命细胞，总体上就会出现双相差异下降，虽然突变分布会影响双相差异下降的定量行为，但对总体动态影响不大，表明研究结果对参数和突变谱的扰动具有稳健性。
研究讨论
- 研究结论的意义：本研究观察到 SIV 感染的恒河猴在 ART 治疗的前约 3 年中，前病毒的差异和估计的整合时间呈双相下降。发现短寿命 CD4+T 细胞携带更具差异的前病毒，而长寿命细胞携带相对较少差异的前病毒，这表明治疗开始时较晚感染的病毒主要存在于短寿命细胞中，而较早感染的病毒存在于长寿命细胞中。基于突变分布和半衰期估计构建的数学模型能够预测 ART 期间的差异动力学，且当短寿命细胞中的病毒序列平均差异大于长寿命细胞时，会出现双相下降，解释了之前实验中关于潜伏库沉积时间的矛盾观察结果。
- 对临床研究的启示：研究结果表明，近期一些主要关注 ART 开始时附近循环病毒的临床试验可能会忽略长寿命细胞中差异较小的前病毒。对于长期接受抑制性 ART 治疗的患者，短寿命细胞死亡后，体内的前病毒相对更易受到免疫压力的影响，这为未来的治疗策略提供了新的思路。
- 研究的局限性
- 模型局限性：模型未考虑克隆扩增等维持病毒库的机制，但在研究的时间范围内（约 3 年），克隆扩增的影响较小，治疗开始后 1 - 7 个月内差异从快速下降转变为缓慢下降，而克隆扩增的显著影响通常在 5 - 10 年后才出现。
- 实验数据局限性：实验数据仅研究了具有非缺陷 env 序列的整合前病毒的 CD4+T 细胞，可能包括生产性感染和静息细胞，且可能存在其他基因组缺陷的前病毒。而实际的潜伏库主要由基因缺陷的前病毒组成，虽然 SIV 基因组相对更完整，但不同研究对于完整和缺陷前病毒的整合时间及其他特性存在不同结论，需要进一步研究。
- 物种差异和样本局限性：研究基于猕猴模型，人与猕猴的生物学差异不能忽视。目前缺乏类似的人类队列数据进行对比，未来需要合适的人类数据集进一步探索。此外，研究仅使用了 PBMCs 样本，未包含其他组织如淋巴结或肠道相关淋巴组织（GALT）的样本，尽管有研究表明 PBMCs、淋巴结和脾脏中的 SIV DNA 群体在 ART 期间无显著变化，但仍需更多研究来确认其他组织的情况。
资源可用性
- 主要联系人：如需进一步信息或资源，可联系主要联系人 Thomas Leitner 博士（tkl@lanl.gov）。
- 材料可用性：本研究未产生新的独特试剂。
- 数据和代码可用性：研究中生成的序列已存入 GenBank，可公开获取，登录号在关键资源表中列出。所有原始代码已存入 GitHub（https://github.com/MolEvolEpid/SIV_divergence_dynamics），也可公开获取。如需重新分析数据的其他信息，可向主要联系人索取。
