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为解决基于二苯甲酮的光酶存在光物理性质局限问题，研究人员开展了编码噻吨酮三线态敏化剂的光酶研究。结果成功开发出高效且耐氧的可见光驱动光酶，可实现现有光催化剂难以达成的转化，推动了生物光催化发展。
在生物光催化领域，大自然就像一个神奇的 “化学工厂”，但现有的 “生产线” 却存在一些麻烦。此前，研究人员开发出含有二苯甲酮三线态敏化剂的 [2 + 2] 环化酶，这类光酶展现出在立体控制能量转移光催化方面的潜力。可二苯甲酮这个 “小助手” 不太给力，它在紫外线（UV）区域的吸光能力弱，还容易和目标底物的吸收光谱重叠，导致竞争直接激发过程，就像两个工人在抢同一份工作，使得选择性催化难以顺利进行。而且，被激发的二苯甲酮还会 “不务正业”，参与一些电子和氢原子转移等非目标过程，严重影响了光化学效率，也限制了可进行的化学反应类型。为了让这个 “化学工厂” 能更高效地生产，解锁更多新颖的化学反应，研究人员迫切需要寻找新的 “得力助手”，也就是开发出性能更优的光酶。
来自英国曼彻斯特大学（The University of Manchester）、德国慕尼黑工业大学（Technische Universit?t München）等机构的研究人员勇挑重担，开启了一场科研探索之旅。他们致力于开发能够利用可见光驱动的高效且选择性的能量转移光酶，期望以此突破现有光酶的局限。经过不懈努力，他们取得了令人瞩目的成果。研究表明，通过对翻译组件进行工程改造，将噻吨酮三线态敏化剂嵌入蛋白质中，成功开发出了新型光酶。这些光酶不仅能高效利用可见光，还具备耐氧性，能够实现现有光催化剂难以达成的选择性转化。该研究成果发表在《Nature Chemistry》上，为生物光催化领域注入了新的活力。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因编码技术，通过合成含有噻吨酮侧链的非天然氨基酸，并对氨酰 - tRNA 合成酶（aaRS）进行改造，实现了噻吨酮在蛋白质中的定点插入。其次，利用定向进化技术，对光酶进行多轮优化筛选，显著提升了光酶的活性和选择性。此外，晶体结构解析技术为深入理解光酶的催化机制提供了关键信息，通过解析光酶的晶体结构，明确了突变对光酶结构和功能的影响。
编码含噻吨酮的非天然氨基酸
研究人员合成了两种含有噻吨酮侧链的区域异构氨基酸。为了将这些氨基酸精准地编码到蛋白质中，他们评估了多种氨酰 - tRNA 合成酶的活性位点文库。起初，直接筛选并未获得理想的变体。随后，他们转变策略，对先前针对结构相似氨基酸改造的 aaRS 变体进行评估，最终发现了对噻吨酮 - 2 - 基丙氨酸（mTX）具有活性的 MjTyrRS 变体（AcdRS2b）。在此基础上，引入 L108W 突变后，进一步提高了 mTX 的掺入效率，为后续光酶的开发奠定了坚实基础。
增强的 [2 + 2] 环化光酶
研究人员以碳连接的喹诺酮衍生物 1 的分子内 [2 + 2] 环加成反应为模型反应。由于该底物在 365nm 光照下会发生直接激发，导致高背景反应，严重影响反应选择性，而噻吨酮在长波长（>395nm）下有良好的吸收，更适合驱动该反应。他们将 mTX 敏化剂安装在 DA_20_00 的 173 位，取代二苯甲酮敏化剂，得到 VEnT1.0。经过三轮定向进化，筛选约 5300 个克隆后，获得了 VEnT1.3。VEnT1.3 的反应产率大幅提高 10 倍，对映选择性达到 > 99% e.e.，催化效率也远超之前的光酶。通过对光酶的光谱特征和三线态寿命研究发现，蛋白质环境对噻吨酮敏化剂的光物理性质有重要影响，进化过程中的有益突变延长了激发态寿命。晶体结构解析和分子对接结果表明，突变导致 mTX 敏化剂重新定位，底物与敏化剂及活性位点残基之间存在多种相互作用，这些相互作用对光酶的催化活性和立体选择性至关重要。
解锁替代光化学
为了拓展光酶的应用范围，研究人员探索了将羧酰胺官能化的喹诺酮 2 转化为相应的螺环 β - 内酰胺 2a 的反应。该反应面临诸多挑战，如底物在 UV 光照下易分解，小分子敏化剂存在反应选择性差和底物分解等问题。研究人员将噻吨酮敏化剂重新定位到 244 位，创建了 SpEnT1.0。经过三轮定向进化，筛选约 3200 个克隆后，获得了优化的 SpEnT1.3。SpEnT1.3 能够高效促进目标转化，产率提高六倍，对映选择性达到 99% e.e.，非对映选择性为 22:1，同时大幅减少了副产物的生成。对 SpEnT1.3 的光物理性质研究表明，其三线态寿命长，受氧气影响小。晶体结构解析和分子对接结果显示，活性位点口袋经过重塑，底物与敏化剂及活性位点残基之间形成了紧密的相互作用，有效控制了反应的选择性。
在研究结论和讨论部分，这项研究成功开发出基于噻吨酮的可见光驱动光酶，为生物光催化带来了新的突破。通过基因编码技术将定制的敏化剂精准安装到蛋白质中，显著提升了光酶的性能。这些光酶能够有效排除不需要的副反应和底物分解途径，有望实现其他系统难以完成的光化学转化。此外，研究结果还表明，遗传密码扩展和定向进化技术在开发新型光酶方面具有巨大潜力。随着遗传密码的不断扩展，未来有望获得更多具有不同光化学和光物理性质的可编码敏化剂，与现代蛋白质设计和高通量酶工程工作流程相结合，将为开发各种有价值的光化学转化酶提供广阔前景，推动生物光催化领域迈向新的高度，为有机合成、药物研发等多个领域带来新的机遇和发展方向。
