酵母源细胞外囊泡培养时长对其特性与功能的影响：解锁再生医学新潜能

为探究能量消耗和发酵过程对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌的细胞外囊泡（EVs）特性及生理功能的影响，研究人员分析不同培养时长的 EVs。结果发现培养时长影响 EVs 特性和功能，该研究为调控 EVs 组成及应用提供策略。

　　在生命科学和健康医学领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）作为一种脂质双层纳米囊泡，正逐渐成为研究的焦点。EVs 能够携带核酸、蛋白质等生物活性分子，在细胞间通讯中发挥着重要作用，对多种生理过程产生影响。目前，基于 EVs 的研究在多个方面展现出巨大潜力，比如作为药物递送载体和治疗剂。然而，利用哺乳动物细胞生产 EVs 面临产量低、成本高的问题，限制了其商业化应用。同时，微生物来源的 EVs 研究尚处于起步阶段，存在诸多未知。就拿真菌来说，其细胞壁的存在使得 EVs 的分泌机制以及成分分析面临挑战，甚至连 EVs 的通用标记都尚未确立。在此背景下，开展对微生物来源 EVs 的深入研究显得尤为迫切。

为了解决上述问题，来自未知研究机构的研究人员开展了一项针对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌的 EVs 的研究。研究人员假设酿酒酵母的 EVs 能够被人类细胞内化并促进胶原蛋白合成，为验证这一假设，他们进行了一系列实验，最终发表在《BIOMATERIALS RESEARCH》上。

在研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过超速离心等方法从不同培养时长的酿酒酵母培养基中分离 EVs；利用纳米颗粒跟踪分析和生物透射电子显微镜对 EVs 的粒径、浓度等特性进行表征；运用蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析特定蛋白质的表达；借助液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）和转录组测序分别进行蛋白质组和转录组分析；采用细胞摄取实验评估 EVs 进入细胞的效率；利用酶联免疫吸附测定（ELISA）、实时聚合酶链反应（RT - PCR）和 Western blotting 检测胶原蛋白合成相关指标。

研究结果如下：

• 酿酒酵母源 EVs 的特性表征：研究人员从不同培养时长的酿酒酵母培养基中成功分离出 EVs，分别为培养 24 小时的 EV@Y₂₄和 72 小时的 EV@Y₇₂。通过分析发现，在 24 小时时，培养基中的葡萄糖耗尽，标志着细胞进入稳定期；72 小时则代表长期培养，此时能量源耗尽，发酵过程延长。纳米颗粒跟踪分析显示，EV@Y₇₂的颗粒数量约为 EV@Y₂₄的 3 倍，但平均粒径更小。进一步研究发现，酵母培养 72 小时释放的 EVs 更多，且其 zeta 电位更高。
• EV@Y₂₄富含晚期内体蛋白 Pep12：通过蛋白质免疫印迹分析不同培养时期酵母细胞和 EVs 的特定蛋白质表达，发现随着培养时间延长，自噬相关蛋白 Atg8 表达增加，而线粒体、内体、内质网和液泡相关蛋白表达下调。在 EVs 中，Pep12 表达随培养时间增加而降低，VMA2 和 GAPDH 表达增加，表明 EV@Y₂₄富含内体相关的 EVs，而 EV@Y₇₂含有更多来自各种细胞器的蛋白质。
• EV@Y₂₄比 EV@Y₇₂更有效地内化进入细胞：利用荧光标记和流式细胞术等方法比较不同 EVs 样品对成纤维细胞的内吞效率，结果显示 EV@Y₂₄和 EV@Y₇₂均能被 Hs27 细胞成功内化，但 EV@Y₂₄的摄取效率比 EV@Y₇₂高 71%，荧光显微镜分析也证实了这一结果。
• EV@Y₂₄和 EV@Y₇₂的蛋白质组分析：蛋白质组分析表明，EV@Y₂₄和 EV@Y₇₂分别鉴定出 223 种和 358 种蛋白质，其中 194 种蛋白质是两者共有的。GO 分析发现，EV@Y₂₄特有的蛋白质中包含与线粒体电子传递和囊泡运输相关的蛋白；EV@Y₇₂含有许多来自各种细胞器的蛋白质。此外，EV@Y₂₄包含大量将乙醛还原为乙醇的酶，而 EV@Y₇₂含有许多将乙醇转化为乙醛的酶，表明酵母 EVs 维持了宿主细胞的代谢状态。
• EV@Y₂₄和 EV@Y₇₂的转录组分析：转录组分析检测到 EV@Y₂₄和 EV@Y₇₂中分别有 1,146 种和 1,158 种 miRNA 序列，大部分序列长度为 18 - 24 nt。通过筛选差异表达的小 RNA 并进行功能分析，发现 EV@Y₇₂可能在抑制肥胖方面更有效，且两者都可能通过靶向表皮生长因子相关过程影响胶原蛋白合成。
• EV@Y₂₄和 EV@Y₇₂促进 Hs27 成纤维细胞的胶原蛋白合成：研究人员用 EV@Y₂₄和 EV@Y₇₂处理 Hs27 成纤维细胞，通过 ELISA、RT - PCR 和 Western blotting 评估其对胶原蛋白合成的影响。结果显示，酵母源 EVs 能促进胶原蛋白 I 和 III 的合成，在浓度为 10⁸ particles/ml 时效果最佳，且 EV@Y₂₄的促进效果比 EV@Y₇₂更显著。

研究结论和讨论部分指出，培养时长对酵母源 EVs 的特性和组成有显著影响。EV@Y₇₂颗粒数量多但粒径小，可能是由于长时间培养导致 EVs 分泌增加和颗粒降解。研究首次提出 Pep12 可作为内体来源 EVs 的特异性标记，EV@Y₂₄更具内体来源外泌体的代表性，而 EV@Y₇₂包含更广泛的 EV 亚群。EV@Y₂₄内吞效率更高，可能与 Pep12 以及 GPI - 锚定蛋白有关。酵母源 EVs 能上调胶原蛋白 I、III 和 MMP1 的表达，在再生医学领域具有巨大潜力。此外，转录组分析发现 EVs 中的 miRNA 可能通过调节 AKT、ERK 和 Wnt 信号通路影响胶原蛋白合成，但具体机制仍需进一步研究。

总的来说，该研究揭示了培养时长对酵母源 EVs 的重要影响，为调控 EVs 的特性和功能提供了新的策略。然而，研究存在一定局限性，如仅控制培养时长，未深入研究培养基成分等其他因素的影响，且缺乏对单个 EV 成分的机制和功能分析。未来研究可从这些方面入手，进一步深入探索酵母源 EVs 的奥秘，为其在再生医学等领域的应用提供更坚实的理论基础。