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多巴胺转运体（DAT）与多种神经精神疾病相关，其配体结合位点存在争议。研究人员运用单分子力谱技术，发现 DAT 存在两个结合位点 S1 和 S2，明确其位置、动力学及结合强度阈值。该成果为药物设计提供关键依据，助力神经精神疾病治疗。
在神经科学领域，多巴胺转运体（DAT）就像一个神秘的 “小卫士”，它的一举一动都和神经精神疾病紧密相连。像注意力缺陷多动障碍（ADHD）、帕金森病，还有让人头疼的物质使用障碍等，这些疾病的背后都有 DAT 的 “身影”。不仅如此，DAT 还是非法药物和临床重要药物的作用靶点，研究它的配体结合位点，对研发更有效的药物、治疗相关疾病十分关键。
可这个 “小卫士” 却很是调皮，现有研究对它的配体结合位点数量和功能说法不一。从已有的晶体和冷冻电镜（cryo - EM）结构数据来看，不同的研究结果相互矛盾，这让科学家们对 DAT 的了解陷入了困境。而且，虽然知道 DAT 有两个潜在的结合位点 S1 和 S2，但 S2 位点在实验中却常常 “隐身”，很难被发现。在这样的背景下，为了揭开 DAT 的神秘面纱，来自奥地利约翰内斯?开普勒大学林茨分校和维也纳医科大学等机构的研究人员展开了一场探索之旅。
研究人员的这一成果发表在《Nature Communications》上，他们通过研究发现，DAT 确实存在两个结合位点 S1 和 S2。不仅如此，还确定了这两个位点的位置、结合动力学特征，并且找到了配体与 DAT 结合强度的阈值，这一发现为解释为什么 S2 位点在传统结构研究中难以被发现提供了关键线索，对后续针对 DAT 的药物设计有着重大意义。
在这场探索之旅中，研究人员主要使用了单分子力谱技术（single molecule force spectroscopy），这一技术就像是给研究人员装上了 “微观放大镜”。借助基于原子力显微镜（AFM）的单分子力谱技术，研究人员能够探测到 DAT 与配体之间微弱的相互作用。同时，他们还利用定点突变技术，对 DAT 上的特定氨基酸进行突变，从而研究这些突变对配体结合的影响。
下面来详细看看研究结果。首先是 “可卡因类似物 MFZ2 - 12 与 AFM 针尖的偶联”，研究人员将 MFZ2 - 12 通过柔性聚乙二醇（PEG）连接子偶联到 AFM 针尖上，成功验证了偶联效果，为后续实验打下基础。
“MFZ2 - 12 与 DAT 的两个结合位点”，研究发现，在有 Zn2 +存在时，MFZ2 - 12 与 DAT 的结合活性会显著提高。通过单分子力测量，发现 MFZ2 - 12 与 DAT 结合时，解离力存在两个不同范围，这表明 DAT 上存在两个结合位点。进一步研究还发现，S1 位点的结合力更强，且受 Na+影响，而 S2 位点结合力较弱，且不依赖于 Na+ 。研究人员还测定了两个位点的结合动力学参数，发现有 Zn2 +时，配体与 S1 位点结合更稳定，结合速率也更快。
“多巴胺和 HAMBA 与 AFM 针尖的偶联”，研究人员对多巴胺和 HAMBA 与 DAT 的相互作用进行研究。发现 HAMBA 与 DAT 的结合存在两个结合位点，同时成功将多巴胺偶联到 AFM 针尖上，也证实了多巴胺在 DAT 上同样存在两个结合位点。
“底物结合的钠依赖性”，研究人员通过用 K+或 N - 甲基 - D - 葡糖胺（NMDG+）替代 Na+，发现 S1 位点的结合事件依赖于 Na+ ，而 S2 位点不受影响。通过对 DAT - V152I 和 DAT - G386H 等突变体的研究，进一步验证了这一结论。
“DAT 中 S2 位点位置的鉴定”，研究人员聚焦于 DAT 细胞外前庭的 K92、K384 和 H477 三个氨基酸残基。通过化学修饰和突变实验，发现 K92 和 K384 参与了多巴胺在 S2 位点的结合，而改变 pH 值实验表明 H477 也与 S2 位点的底物结合有关。并且发现 S2 位点有助于多巴胺进入 S1 位点。
“为什么晶体结构能捕获 SERT 中 S2 位点的配体，却不能捕获 DAT 中的？”，研究发现，与 SERT 不同，在 DAT 中，S1 位点的配体不会增强 S2 位点的结合强度，没有正变构效应。研究人员还推测存在一个结合强度阈值，低于该阈值的结合位点在 X 射线晶体学或冷冻电镜结构中难以被检测到，而 AFM 技术具有更高的灵敏度。
在研究结论和讨论部分，研究人员成功证明了 DAT 中 S2 结合位点的存在，并获得了其结合动力学参数。这一发现揭示了 DAT 能支持多种配体结合模式，为理解 DAT 在健康和疾病状态下的功能机制提供了重要依据。同时，也为设计双位点或双功能药物提供了新的思路，有望开发出更高效、副作用更小的治疗神经精神疾病的药物，在未来的临床治疗中发挥重要作用。
