揭秘大 B 细胞淋巴瘤治疗新突破：CD8+ CAR-T 细胞的两阶段分化之旅

弥漫大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）治疗中，CAR-T 细胞疗法效果受其分化机制不明影响。研究人员对接受 axicabtagene ciloleucel 治疗的 DLBCL 患者的 CD8+ CAR-T 细胞展开研究，发现其存在两阶段分化，这为优化 CAR-T 细胞疗法提供依据。

　　在淋巴瘤的治疗领域，弥漫大 B 细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是美国最常见的非霍奇金淋巴瘤。对于初治难治或缓解后复发（r/r DLBCL）的患者而言，治疗选择极为有限，预后也不容乐观 。直到 2017 年，美国食品药品监督管理局批准了针对 r/r DLBCL 的自体 CD19 导向的嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR）T 细胞疗法，这才为患者带来了新的希望。然而，这种疗法也面临着诸多挑战，比如非缓解率较高、治疗毒性较大等问题。而且，目前人们对 CAR - T 细胞在患者体内的分化过程了解并不充分，这严重限制了 CAR - T 细胞疗法的进一步发展。因此，深入探究 CAR - T 细胞在患者体内的分化机制，对于开发更高效、低毒的 CAR - T 细胞疗法至关重要。

为了解决这些问题，来自美国芝加哥大学（University of Chicago）的研究人员 Guoshuai Cao、Yifei Hu 等开展了一项研究。他们通过对接受 axicabtagene ciloleucel 治疗且完全缓解的 7 例 r/r DLBCL 患者进行研究，发现 CD8⁺ CAR - T 细胞在体内会经历两个不同的克隆扩增阶段，这一发现为 CAR - T 细胞疗法的优化提供了重要依据。该研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。他们收集了患者的外周血和输注产品样本，采用单细胞多模态分析技术，包括配对 RNA 测序（RNA-seq）、细胞索引测序（CITE-seq）和 T 细胞受体测序（TCR-seq），对样本中的 CAR - T 细胞进行分析。同时，通过构建 CD19 四聚体来分选 CAR - T 细胞，并运用流式细胞术对细胞表型进行验证。此外，还利用基因集富集分析（GSEA）、差异基因表达分析（DGEA）和调节网络分析等手段，深入探究 CAR - T 细胞的转录特征和调控机制。

下面来具体看看研究结果：

• 研究设计和临床发现：研究人员对 7 例接受 axicabtagene ciloleucel 治疗并达到完全缓解的患者进行纵向研究。在治疗过程中的 3 个时间点，即峰值扩增（T_exp，第 8 - 14 天）、早期峰值后持续期（T_peri，第 21 天）和晚期峰值后持续期（T_per2，第 28 天），采集患者的输注产品和外周血样本进行单细胞多模态分析。通过 CD19 抗原四聚体分选 CAR - T 细胞，验证了分选策略的有效性。
• CD8⁺ CAR - T 细胞在 T_exp和 T_per之间发生克隆型转变：分析发现，CAR - T 细胞在峰值扩增时，其丰度在 11% - 73% 之间，且大多数时间点和患者中，CAR - T 细胞以 CD8⁺为主。通过单细胞 TCR - seq 追踪克隆型动态变化，发现 T_exp的克隆型与 T_peri或 T_per2的克隆型存在显著差异，且这种差异由 CD8⁺ T 细胞驱动，是 CAR 特异性的。
• CD8⁺ CAR - T 细胞从耗尽样效应记忆向终末效应表型转变：对 CD8⁺ CAR - T 细胞进行聚类分析，发现 6 个 T 细胞簇。在 T_exp时，CAR - T 细胞主要为耗尽样效应记忆（EM）表型（占 64%）；而在 T_per时，主要为终末效应（TE）表型（T_peri时占 63%，T_per2时占 77%）。这表明 CD8⁺ CAR - T 细胞在 T_exp和 T_per之间发生了表型转变。
• CD4⁺ CAR - T 细胞维持记忆表型并伴有 CAR Treg 持续存在：对 CD4⁺ CAR - T 细胞进行聚类和注释分析，鉴定出 5 个 T 细胞簇。CD4⁺ CAR - T 细胞在所有时间点主要表现为记忆（Mem）表型（占 49% - 82%）。在治疗过程中，Mem 比例逐渐下降，Th1 比例逐渐增加，同时 CAR Tregs 比例稳步上升，表明其在峰值扩增后仍持续存在于外周血中。
• 整合 CD8⁺ CAR - T 细胞的克隆型和表型转变支持两阶段分化模型：将 CD8⁺ CAR - T 细胞的克隆型和表型通过细胞条形码进行关联分析，发现存在两个不同的体内克隆扩增波。第一波由具有耗尽样 EM 表型的 CAR - T 细胞主导，在 T_exp时达到高峰；第二波由具有 TE 表型的 CAR - T 细胞主导，在 T_per时占优势。这一结果支持了 CD8⁺ CAR - T 细胞的两阶段分化模型。
• T_exp和 T_per特异性的转录特征和调节网络：通过 GSEA、DGEA 和调节网络分析，发现 T_exp的 CAR - T 细胞上调细胞周期和凋亡相关基因集，以及 T 细胞激活和耗尽相关基因；T_per的 CAR - T 细胞则上调细胞毒性和免疫调节相关基因集。同时，还鉴定出了与 T_exp和 T_per相关的关键调节因子和调节网络。
• CD8⁺ CAR - T 细胞在 T_exp和 T_per起源于输注产品中的不同前体：通过 TCR 谱系追踪分析，研究人员发现 CD8⁺ CAR - T 细胞在 T_exp和 T_per分别起源于输注产品中具有不同特征的前体。T_exp的前体具有更多效应样特征，而 T_per的前体具有更多干细胞样特征。
• T_exp时 CD8⁺耗尽样 EM CAR - T 细胞表现出早期耗尽的特征：对耗尽样 EM 簇进行深入分析，发现其高表达耗尽相关转录因子和抑制性受体，同时具有记忆和效应基因的中间表达水平。通过与参考数据集的比较，证实该簇表现出早期耗尽的特征。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 CD28 共刺激的 CD8⁺ CAR - T 细胞在体内的两阶段分化模型。这一模型表明，CAR - T 细胞的扩增和持久性由不同的细胞群体介导，它们在生物学上是不相关的。这一发现对于理解 CAR - T 细胞的扩增和持久性具有重要意义，为开发更有效的个性化 CAR - T 细胞疗法提供了理论基础。通过操纵输注产品的表型组成，有望更精确地控制体内 CAR - T 细胞的分化，从而调节治疗效果。然而，该研究也存在一定的局限性，如样本仅来自外周血和输注产品，未涉及其他部位；未充分考虑 CAR - T 细胞与体内复杂环境的相互作用；无法排除在输注后短期内或长期内存在其他克隆扩增波的可能性；且两阶段分化模型在其他情况下的适用性尚待研究。未来的研究可以针对这些局限性展开，进一步深入探究 CAR - T 细胞的分化机制和治疗效果。