大规模转录组挖掘实现环肽支架的多样化改造与生物活性提升

为解决植物核糖体肽(RiPPs)发现效率低下的问题，密歇根大学团队通过优化RNA-seq组装算法，构建了涵盖7579种植物的可搜索转录组数据库。研究发现SPAdes是最佳组装工具，成功鉴定了37种含BURP结构域的环肽合成酶，并发现新型双环肽glechomanin（Val-Trp交联）和mercurialin（Phe-Tyr交联）。特别从水繁缕中分离的moroidin-QLLVWRNH对H1437肺癌细胞IC50达1.4μM，活性较前体提升5倍。该研究为植物源抗癌先导化合物开发提供了新思路。

　　

植物王国蕴藏着丰富的核糖体合成翻译后修饰肽(RiPPs)，这类由前体肽经酶加工形成的环状分子在抗癌、免疫调节等领域展现出巨大潜力。然而当前植物RiPPs的发现面临两大瓶颈：一是NCBI序列读段存档(SRA)中近万种植物的RNA-seq数据因未组装而难以挖掘；二是关键前体基因常含重复序列，导致常规组装算法准确率低下。更棘手的是，具有药用价值的stephanotic acid型环肽（如抗癌肽moroidin）结构复杂，其双环系统的第二环修饰机制尚不明确，严重制约了该类分子的定向改造。

为突破这些限制，密歇根大学的研究团队开发了革命性的转录组挖掘流程。通过系统评估Trinity、SPAdes和MEGAHIT三种组装工具对36个已知RiPP前体基因的组装效果，发现SPAdes在重复序列组装准确率（达62%）和计算效率上表现最优。利用该工具，研究人员成功将7579种植物的RNA-seq数据转化为可搜索数据库，规模远超此前植物千转录组计划(1KP)的SOAPdenovo-trans组装结果。这项开创性工作发表于《Nature Communications》，为植物天然产物的高效发现树立了新标杆。

研究采用多组学联用策略：首先通过PHI-BLAST筛选BURP结构域蛋白，结合RepeatFinder预测核心肽；利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统验证候选环肽的生物合成；运用800MHz核磁共振和Marfey's分析解析绝对构型；最后通过高内涵成像评估抗癌活性。样本涵盖水繁缕等7个科属植物，包括密歇根大学植物标本馆保存的标本。

在组装算法优化方面，研究揭示SPAdes对重复序列的卓越处理能力：相比Trinity和MEGAHIT，其组装的重复核心肽数量分别提高67%和44%。通过分析27个RNA-seq数据集，发现SPAdes组装的转录本与真实前体肽序列相似度达81.4%，为大规模挖掘奠定基础。特别值得注意的是，重新组装的1KP数据使moroidin环肽合成酶的检出率从3种提升至5种，证明该方法可显著提高稀有化合物的发现概率。

新型环肽结构的发现是另一重要突破。从活血丹中分离的glechomanin展现出独特的Val⁴-Trp⁷交联模式，HMBC谱图清晰显示Val-Hγ与Trp-C₆的相关性（δ_H 2.87，dd，J=3.1,11.6Hz）。而来自一年生山靛的mercurialin则形成罕见的Phe⁴-Tyr⁷醚键，其交联位点通过NOESY中Phe-Hβ与Tyr-H3/H5的相关性得以确认。这两种双环肽的发现丰富了植物RiPPs的结构多样性。

最具临床价值的是从水繁缕中鉴定的moroidin-QLLVWRNH。该分子对H1437非小细胞肺癌细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)仅为1.4μM，比已知最活性类似物celogentin C提高5倍，且在IMR-90等正常细胞系中未显示毒性。结构-活性关系研究表明，第二环中Arg⁶替代原有Gly是活性提升的关键，这为后续结构优化提供了明确方向。

从生物合成角度看，研究首次证实BURP结构域蛋白具有催化多类型交联的能力。体外实验显示，重组GheBURP-1xQLFVWGW在Cu²⁺存在下可自发形成双环结构，质谱检测到核心肽丢失4个氢（Δm/z=-4Da），对应两处C-C交联的形成。这种自催化特性为合成生物学改造提供了便利平台。

该研究不仅将stephanotic acid型环肽的分布扩展到禾本科、芭蕉科等新类群，更重要的是建立了从海量转录组数据中挖掘活性肽的标准化流程。提出的"组装-搜索-验证"三步骤策略，克服了传统基因组挖掘在植物中应用受限的难题。发现的moroidin-QLLVWRNH作为肺癌治疗先导化合物，其独特的作用机制有待进一步阐明，而glechomanin和mercurialin合成酶则为构建非天然环肽库提供了新工具。这项工作标志着植物RiPPs研究从经验发现向理性设计的重要转变，为开发下一代植物源药物开辟了道路。