单蛋白分辨率下生物分子寡聚化的空间与化学计量原位分析新方法SPINNA

《Nature Communications》：Spatial and stoichiometric in situ analysis of biomolecular oligomerization at single-protein resolution

研究团队针对超分辨显微技术中1-20 nm尺度分子排列定量分析的难题，开发了SPINNA分析框架。该方法通过比较实验数据与模拟的最近邻距离，定量解析了EGFR经EGF处理后的寡聚化状态及CD80/PD-L1二聚体空间构型，为免疫信号和癌症靶向治疗研究提供了单蛋白水平的分析工具。成果发表于《Nature Communications》。

论文解读

背景与挑战
细胞膜受体通过寡聚化调控信号传导，但其纳米级空间排列与化学计量关系长期难以解析。尽管超分辨显微技术（如DNA-PAINT和RESI）已实现单蛋白定位精度，现有分析方法仍无法在1-20 nm尺度定量评估蛋白质的寡聚状态和几何构型。例如，表皮生长因子受体（EGFR）的激活机制涉及从单体到高阶寡聚体的动态转变，而免疫检查点分子CD80与PD-L1的顺式二聚化模式直接影响T细胞功能。这些过程的精确解析对癌症靶向治疗和免疫调节药物设计至关重要，但传统生化方法无法捕捉原位条件下的空间异质性和瞬时相互作用。

研究设计与技术方法
德国马克斯·普朗克生物化学研究所的Luciano A. Masullo和Ralf Jungmann团队开发了SPINNA（Single-Protein Investigation via Nearest-Neighbor Analysis）分析框架。该技术整合DNA-PAINT超分辨成像（定位精度~3 nm）与基于模型的蒙特卡洛模拟，通过比较实验与模拟的最近邻距离（NND）分布，量化寡聚化比例和几何构型。研究使用DNA折纸结构验证准确性，并在A549（EGFR-mEGFP）和CHO（CD80/PD-L1共转染）细胞中应用，结合抗GFP/mCherry纳米抗体标记和Exchange-PAINT多轮成像技术。

研究结果

概念验证：DNA折纸模型
通过设计线性与三角形排列的DNA折纸结构（间距15 nm），SPINNA准确区分了二者几何构型，拟合误差<5%。在1:1混合样本中，SPINNA检出54%线性三聚体与46%三角形三聚体，与条形码验证结果（50.3% vs 49.7%）高度一致，证实其对寡聚体构型的解析能力。

EGFR寡聚化动态
在EGF刺激的A549细胞中，SPINNA分析显示EGFR寡聚化比例从静息态的11±4%升至38±9%，最佳拟合距离为21 nm。该结果首次在单蛋白水平证实EGF诱导的EGFR四聚体形成，为靶向药物设计提供了空间构型依据。

免疫检查点二聚化
在CHO细胞中，CD80与PD-L1的顺式相互作用通过SPINNA量化：27±5%为异源二聚体，PD-L1同源二聚体占35±11%，而CD80单体仅4±3%。值得注意的是，89%的CD80和66%的PD-L1参与寡聚化，提示免疫调控中空间排列的关键作用。

结论与意义
SPINNA突破了超分辨数据分析的瓶颈，首次实现原位条件下蛋白质寡聚化状态（如EGFR四聚体）与几何构型（如CD80/PD-L1异源二聚体）的同步定量。其开源Python工具包（含GUI）支持个性化模型构建，可拓展至三维分析。该技术为癌症靶向治疗（如EGFR抑制剂优化）和免疫疗法（如PD-1/PD-L1通路调控）提供了分子尺度的诊断工具，未来或推动“空间分子诊断”在精准医疗中的应用。研究通过《Nature Communications》发表，标志着单蛋白分析进入空间定量新时代。