嗜酸乳杆菌与刺梨渣协同提升苜蓿青贮沼气生产潜力及优化发酵品质

本文研究了嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和刺梨渣（RP）对苜蓿青贮发酵品质和细菌群落的影响。结果表明，二者协同可提高青贮营养保存、促进厌氧发酵、增加甲烷产量，为苜蓿沼气生产提供有效策略。

　　

引言

随着全球能源需求增长和环境问题加剧，探索生物能源生产的潜在资源至关重要。生物质作为可再生能源，在可持续沼气生产中具有重要意义。苜蓿（Medicago sativa L）富含蛋白质等营养成分，是优良的沼气生产原料，但存在水溶性碳水化合物（WSC）不足的问题。刺梨（Rosa roxburghii）在中国贵州广泛种植，其加工产生的刺梨渣（RP）含有丰富的 WSC，且易腐烂造成资源浪费和环境污染。青贮是一种保存生物质用于沼气生产的有效技术，同时可作为生物预处理方法减少发酵损失。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是一种产沼气细菌，能产生多种有机酸促进沼气生产。本研究旨在评估 RP 和嗜酸乳杆菌单独或联合对苜蓿厌氧储存过程中细菌群落组成和挥发性脂肪酸（VFAs）合成的影响，为提高苜蓿沼气生产潜力提供理论依据。

材料与方法

1. 微生物制备：嗜酸乳杆菌由广州华为生物技术有限公司提供，在青贮前于 MRS 培养基上培养计数，并用蒸馏水稀释至合适浓度，青贮过程中每千克鲜重（FW）添加 10 mL。
2. 苜蓿样品处理：2022 年 7 月 11 日在贵州安顺收获苜蓿，RP 来自贵州恒力源天然生物科技有限公司。将苜蓿切碎与不同添加剂混合后装入聚乙烯袋密封，设置 4 个处理组：CK（无添加剂，添加 5% FW 蒸馏水）、R（添加 5% FW RP）、L（添加嗜酸乳杆菌，浓度为 2×10⁷ cfu/g FW）、RL（添加 5% FW RP 和嗜酸乳杆菌，浓度为 2×10⁷ cfu/g FW）。每组设置 3 个重复，在室温（22℃ - 25℃）黑暗条件下储存，在不同时间点取样分析化学组成、发酵品质、细菌群落组成，储存 50 天后测定体外消化率、产气和甲烷排放。
3. 苜蓿样品化学分析：取 20 g 苜蓿样品与 180 mL 蒸馏水混合，破壁过滤后测定发酵指标。采用钠次氯酸盐 - 酚法测定氨氮（NH₃-N）浓度，高压液相色谱法测定乳酸（LA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）浓度。通过烘干法测定干物质（DM）含量，采用蒽酮法、凯氏定氮法、Van Soest 法分别测定 WSC、粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量。
4. 苜蓿样品细菌群落分析：采用 CTAB 法提取苜蓿样品微生物 DNA，进行纯度和浓度检测。以稀释后的基因组 DNA 为模板，用带条形码的特异性引物进行聚合酶链反应（PCR）扩增，构建 SMRT Bell 文库，在 PacBio 平台测序。原始数据经处理后，利用 1514R 和 27F 引物扩增 16S 核糖体 RNA（rRNA）基因，在 Illumina MiSeq 平台测序。利用相关软件和平台进行数据分析和可视化。
5. 苜蓿样品体外瘤胃厌氧发酵产气特性分析：按照 Menke 等的方法进行体外厌氧发酵实验。收集装有瘤胃瘘管的 5 头公牛的瘤胃液，过滤后与人工缓冲溶液混合制备混合瘤胃接种物。将厌氧储存的苜蓿样品精确称重后放入过滤袋，加入瘤胃接种物，在 39℃下孵育 72 h，定期记录产气情况，收集气体和发酵液测定甲烷产量和 VFAs 含量。采用 Contreras 等的方法测定苜蓿样品体外消化率。
6. 统计分析：对每组 3 个重复测量数据计算平均值和标准差，采用方差分析（ANOVA）在 P < 0.05 水平进行显著性检验，使用 GraphPad Prism 9.0 绘制图表。

结果与讨论

1. 厌氧储存前苜蓿和刺梨渣的化学组成：厌氧储存前，苜蓿和 RP 的 DM 含量分别为 27.88% 和 29.55%，可用于 LA 发酵。苜蓿的 NDF 和 ADF 含量分别为 43.51% DM 和 29.21% DM，RP 的 NDF 和 ADF 含量分别为 46.65% DM 和 25.14% DM。苜蓿的 WSC 含量为 4.62% DM，低于新鲜收获草料确保发酵质量所需的 WSC 比例（>5% DM），而 RP 的 WSC 含量为 5.03% DM，可为苜蓿厌氧发酵提供更多 WSC。
2. 厌氧储存过程中苜蓿样品的化学组成：随着厌氧发酵进行，各处理组的 DM、CP、NDF、ADF 和 WSC 含量逐渐降低。L 和 RL 处理组的 CP 含量高于 CK 处理组，可能是嗜酸乳杆菌快速创造低 pH 环境抑制蛋白酶活性，以及 RP 中的单宁与蛋白质结合阻碍蛋白质分解。L 和 RL 处理组的 NDF 含量低于 CK 处理组，RL 处理组的 ADF 含量最低，R 处理组的 NDF 和 ADF 含量较高可能与 RP 中大量木质素有关。R 和 RL 处理组的 WSC 含量较高，可能与 RP 中较高的 WSC 含量有关，表明嗜酸乳杆菌与 RP 联合处理有效提高了苜蓿样品的营养保存。
3. 厌氧储存过程中苜蓿样品的发酵特性：CK、L 和 RL 处理组样品的 pH 在厌氧储存过程中持续下降，RL 处理组样品 pH 下降最快。LA、AA 和 PA 是厌氧储存过程中的主要有机酸。L 和 RL 处理组的 LA 含量显著高于 CK 处理组，RL 处理组的 LA 含量最高，表明嗜酸乳杆菌和 RP 协同影响 LA 产量。R、L 和 RL 处理组的 AA 含量高于 CK 处理组，可能是苜蓿青贮样品中存在某些异型发酵乳酸菌将 LA 转化为 AA。PA 含量在厌氧储存过程中逐渐增加，但 R 处理组除外。所有苜蓿样品中均未检测到 BA，表明本研究有效限制了梭菌发酵。L 和 RL 处理组的 NH₃-N 含量低于 CK 处理组，RL 处理组的 NH₃-N 含量最低，表明 RP 和嗜酸乳杆菌具有协同作用，抑制了有害细菌生长，促进了乳酸菌的优势生长，阻碍了导致 CP 降解的细菌发展。
4. 厌氧储存过程中苜蓿样品的细菌群落组成：厌氧储存过程中，由于乳酸菌产生的酸性环境抑制了许多微生物的生长，细菌多样性指数下降，RL 处理组的细菌多样性最低。新鲜苜蓿样品中，Kosakonia和Enterobacter占优势，厌氧储存后，Lactobacillus和Lactococcus的相对丰度显著增加。随着厌氧储存的进行，Lactococcus的相对丰度下降，Lactobacillus的相对丰度增加。RL 处理组显著提高了Lactobacillus的相对丰度，降低了Kosakonia和Enterobacter的相对丰度。新鲜收获苜蓿样品中，Kosakonia cowanii占优势，厌氧储存后，Lactiplantibacillus plantarum的相对丰度显著增加。RL 处理组对提高Lactiplantibacillus plantarum的相对丰度影响最大，降低了Lactococcus lactis、Kosakonia cowanii和Enterococcus mundtii的相对丰度。主坐标分析（PCoA）结果表明，LAB 和 RP 分别是厌氧发酵中后期苜蓿样品细菌群落变化的主要驱动因素。
5. 厌氧储存过程中苜蓿样品细菌群落与青贮特性的相关性：典范对应分析（CCA）结果表明，在厌氧储存的不同时间点，RP 对提高 WSC 含量至关重要，嗜酸乳杆菌和 RP 的组合对提高 LA 和 AA 水平、保存 CP、降低 NH₃-N、NDF 和 ADF 水平可能至关重要。
6. 苜蓿样品的甲烷产量保存和厌氧发酵特性：体外厌氧发酵实验中，苜蓿样品厌氧发酵后的气体（包括甲烷）累积排放量逐渐增加，RL 处理组以及 R 和 L 处理组的产气和沼气产量均高于 CK 处理组。RL 处理组的总气体和沼气产量更高，可能归因于其较高的 WSC 含量和较低的 ADF 含量。R、L 和 RL 处理组的干物质消化率（DM digestibility）高于 CK 处理组，RL 处理组的 DM digestibility 最高。RP 因高膳食纤维含量可提高 DM digestibility，LAB 对厌氧储存样品的消化率也有积极影响。RL 处理组增加了乙酸和丁酸浓度以及乙酸 / 丙酸比值，降低了丙酸浓度。乙酸可促进后续厌氧发酵产气，丙酸抑制产甲烷细菌增殖，丁酸也可参与沼气生成过程，表明嗜酸乳杆菌和 RP 的组合可有效促进厌氧发酵，提高沼气产量。

结论

总体而言，与对照处理相比，嗜酸乳杆菌和 RP 共接种不仅增加了 LA 和 WSC 含量，还通过提高Lactobacillus的丰度抑制了Kosakonia的生长，增强了厌氧发酵。体外瘤胃发酵实验结果表明，嗜酸乳杆菌和 RP 共接种提高了苜蓿样品的 DM digestibility 和中间代谢产物（主要是乙酸）水平，为沼气生产提供了更多可发酵的生物质。RP 和嗜酸乳杆菌的联合应用对提高苜蓿样品的生物质保留和沼气生产具有有益的协同作用。因此，RP 和嗜酸乳杆菌共接种为苜蓿沼气生产提供了一种有效的储存和预处理策略，青贮技术为利用水果废弃物提高甲烷产量、降低成本并与其他预处理技术协同优化甲烷生成潜力提供了有吸引力的机会。