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本文聚焦 PARK7（DJ-1）蛋白，研究发现 6 - 羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的自噬通量对其非传统分泌至关重要。PARK7 经伴侣介导的自噬（CMA）转运至溶酶体，特定 SNARE 复合体促进其分泌。该成果为 PARK7 相关疾病治疗策略开发提供关键依据。
引言
在细胞的复杂生命活动中，蛋白质分泌扮演着关键角色。真核细胞的蛋白质分泌途径主要分为传统和非传统两种。传统途径依赖内质网（ER）和高尔基体，而一些缺乏 N 端信号肽的蛋白质则通过非传统途径分泌，其具体机制尚在探索中。自噬作为细胞内重要的降解和回收过程，不仅参与维持细胞内环境稳态，还与蛋白质分泌存在密切联系。
PARK7（DJ-1）是一种多功能蛋白，在细胞内发挥着抗氧化、促进细胞存活和调节基因表达等重要作用。它与多种疾病的发生发展相关，如帕金森病（PD）、癌症、中风和炎症等。在多种病理状态下，PARK7 的分泌会增加，然而其具体分泌机制一直是科学界关注的焦点。此前研究表明，PARK7 的分泌依赖非传统自噬途径，但其中的具体分子机制和调控步骤仍不明确。本研究旨在深入探究 6 - 羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的 PARK7 非传统分泌机制，为相关疾病的治疗提供新的理论依据。
6-OHDA 诱导 HeLa 细胞中 PARK7 的非传统分泌
研究人员将实验拓展到人类宫颈癌细胞 HeLa 细胞，以探究 PARK7 在中枢神经系统外的分泌情况。用 6-OHDA 处理 HeLa 细胞后，收集无血清条件培养基，通过三氯乙酸沉淀法沉淀分泌蛋白，再经蛋白质免疫印迹（WB）分析发现，6-OHDA 处理呈剂量依赖性地增加 PARK7 分泌，且该过程不依赖细胞死亡，因为培养基中乳酸脱氢酶（LDH）释放量极少。
为确定 PARK7 分泌是否通过传统 ER - 高尔基体途径，研究人员使用布雷菲德菌素 A（BFA）阻断 ER 到高尔基体的转运。结果显示，BFA 能阻断传统分泌蛋白纤连蛋白 1（FN1）的分泌，但对 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌无影响。同时，通过超速离心分离细胞外囊泡（包括外泌体），WB 分析发现 PARK7 仅存在于可溶性部分，且外泌体释放抑制剂 GW4869 不抑制 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌。这些结果表明，6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌利用了一种独立于传统分泌途径和外泌体释放的非传统途径。
6-OHDA 处理诱导自噬并促进自噬体 - 溶酶体融合
为了解 6-OHDA 在 PARK7 分泌中的潜在作用，研究人员探究了其对 HeLa 细胞自噬的影响。用不同剂量的 6-OHDA 处理 HeLa 细胞 3 小时后，检测自噬体标记物 LC3B 和自噬底物 SQSTM1，发现 6-OHDA 处理呈剂量依赖性地增加 LC3B - II 水平，降低 SQSTM1 水平，这表明自噬被激活。
为进一步确定 6-OHDA 是诱导自噬通量增加还是阻断下游自噬步骤，研究人员使用了巴弗洛霉素 A1（BafA1）和氯喹（CQ）这两种溶酶体酸化和自噬体 - 溶酶体融合抑制剂。结果显示，6-OHDA 与这两种抑制剂联合处理，相比单独使用抑制剂，显著增加了 LC3B - II 水平，说明 6-OHDA 是自噬通量的诱导剂。
研究人员还利用瞬时表达 mRFP - GFP 串联荧光标记的 LC3（tfLC3）的 HeLa 细胞，通过荧光显微镜观察发现，6-OHDA 处理后，黄色（自噬体）和红色（自噬溶酶体）斑点数量均显著增加，这进一步证明 6-OHDA 激活了 HeLa 细胞的自噬，促进了自噬体形成、自噬体 - 溶酶体融合，最终增加了自噬通量。
PARK7 分泌需要自噬起始
为研究自噬对 PARK7 分泌的必要性，研究人员使用了 MRT68921，它通过阻断 ULK1 来抑制自噬早期阶段。结果发现，MRT68921 处理显著减少了 6-OHDA 诱导的 LC3B - II 形成和 PARK7 分泌。此外，在缺乏 FIP200（ULK1 - ATG13 - FIP200 自噬体形成复合物的组成部分）的 HeLa 细胞中，6-OHDA 处理后 LC3B - II 转换变化极小，PARK7 分泌也受到抑制。
相反，用自噬诱导剂雷帕霉素处理 HeLa 细胞，增加了 LC3B - II 水平，同时剂量依赖性地增强了 PARK7 分泌。用抗氧化剂 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）抑制 6-OHDA 诱导的氧化应激，有效抑制了自噬（降低 LC3B - II 水平），几乎消除了 PARK7 分泌。这些结果表明，自噬诱导对 PARK7 分泌至关重要，应激诱导的自噬可增强其释放，凸显了细胞应激、自噬和 PARK7 分泌之间的相互作用。
自噬体 - 溶酶体融合对 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌至关重要
由于 6-OHDA 处理诱导自噬通量，研究人员探究了溶酶体在 PARK7 分泌中的作用。用 CQ 或 CQ 与 NH4Cl 联合处理 HeLa 细胞，抑制自噬体 - 溶酶体融合和自噬溶酶体降解，结果导致 LC3B - II 和 SQSTM1 积累，证实自噬通量受损。同时，溶酶体抑制导致细胞内 PARK7 显著增加，分泌减少，表明溶酶体对 PARK7 稳态有积极调节作用。此外，BafA1 或 CQ 处理抑制自噬体 - 溶酶体融合，几乎消除了 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌。亚细胞分级实验显示，6-OHDA 处理后，PARK7 在 LAMP1 阳性溶酶体部分大量积累，免疫荧光分析也表明 6-OHDA 处理增强了 PARK7 与晚期内体 / 溶酶体标记物 LAMP2 的共定位。这些结果表明，溶酶体参与是 6-OHDA 诱导的氧化应激期间调节 PARK7 分泌的关键机制。
研究人员进一步研究了 STX17 在 PARK7 分泌中的作用。STX17 缺陷会阻断自噬通量，导致 LC3B - II 积累。在 STX17 敲除的 HeLa 细胞（STX17-/-）和通过 siRNA 介导敲低 Stx17 的 MEF 细胞中，均观察到 LC3B - II 和 SQSTM1 积累，表明自噬溶酶体形成受损，同时 PARK7 分泌在 6-OHDA 刺激下也显著受到抑制。这表明 STX17 介导的自噬体 - 溶酶体融合对高效的 PARK7 分泌至关重要。
6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌中自噬体 - 溶酶体融合独立于 STX17 - SNAP29 或 STX17 - SNAP47 SNARE 复合体
在证明 STX17 对 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌至关重要后，研究人员探究了特定 SNARE 蛋白在自噬体 - 溶酶体融合复杂机制中的作用。首先聚焦于 SNAP29，它是一种已知与 STX17 相互作用并介导自噬体 - 溶酶体融合的 Qbc - SNARE 蛋白。通过 siRNA 敲低 MEF 细胞中的 Snap29，发现其导致 LC3B - II 和 Sqstm1 积累，抑制了自噬通量，但与 Stx17 敲低不同，Snap29 敲低并未减少 Park7 分泌，反而使 6-OHDA 诱导的 Park7 分泌略有增加。用类似方法敲低 Snap47，同样观察到 LC3B - II 积累，而 6-OHDA 处理后 Park7 分泌增加。这些结果表明，虽然 PARK7 分泌依赖自噬体 Qa - SNARE STX17 形成自噬溶酶体，但 Qbc - SNAREs SNAP29 和 SNAP47 在 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌中似乎并非必需。
6-OHDA 不影响溶酶体完整性
研究人员进一步探究了溶酶体在 PARK7 分泌中除自噬通量外的作用。用 pH 敏感的 LysoTracker Red 探针检测发现，BafA1 处理后红色荧光斑点强度降低，而 6-OHDA 处理与对照相比，总体红色荧光信号无变化，这表明 6-OHDA 不会引起显著的溶酶体 pH 变化或严重破坏溶酶体完整性。用溶酶体膜通透性（LMP）标记物半乳糖凝集素 - 3（LGALS3）进行免疫荧光分析，已知 LMP 诱导剂 L - 亮氨酰 - L - 亮氨酸甲酯（LLOMe）处理导致 LGALS3 点状染色与溶酶体标记物 LAMP1 共定位，而 6-OHDA 处理未诱导 LGALS3 点状形成，表明无明显 LMP。这些结果表明，在实验参数范围内，6-OHDA 暴露不会诱导 LMP 或损害溶酶体稳态。
研究人员还探索了其他细胞蛋白质降解途径在 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌中的作用。用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理，未显著影响细胞内或分泌的 PARK7 水平，且不改变 6-OHDA 对 PARK7 水平的影响，这表明泛素 - 蛋白酶体系统在这种情况下不参与 PARK7 分泌，PARK7 的降解和分泌与溶酶体功能密切相关。
一组独特的 SNARE 成员介导 PARK7 释放到细胞外环境
为了解自噬溶酶体参与 PARK7 非传统分泌的机制，研究人员探究了特定 SNARE 蛋白在 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌中的作用。根据 SNARE 假说，SNARE 复合体由四种膜蛋白（Qa -、Qb -、Qc - 和 R - SNAREs）组成，介导膜融合。研究人员关注到 Sec22b，它是一种与高尔基体 - ER 转运相关的 R - SNARE 蛋白，近期研究表明其参与自噬体形成和通过自噬体 - 质膜融合的非传统蛋白质分泌。通过 siRNA 敲低 MEF 细胞中的 Sec22b，发现其不影响自噬体形成（通过 LC3B - II 蛋白水平衡量），但显著减少了 Park7 分泌，凸显了 Sec22b 在调节 Park7 分泌中的重要作用。
基于 Sec22b 与质膜 syntaxins 的相互作用，研究人员筛选了先前报道的参与融合事件的质膜 SNAREs。单独敲低质膜 Qa - SNAREs syntaxin 3（Stx3）或 syntaxin 4（Stx4）部分抑制了 MEF 细胞中 Park7 分泌，而同时敲低两者则消除了 6-OHDA 诱导的分泌。在研究 Qbc - SNARE 候选蛋白时，发现敲低 Snap23 不影响 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌，Snap29 敲低则略有增加，两者联合敲低也无影响。
由于功能性溶酶体对 PARK7 分泌至关重要，研究人员检测了内溶酶体 SNAREs：Vti1a/b（Qb - SNAREs）和 syntaxin 8（Stx8，Qc - SNARE）的作用。敲低 Vti1b（而非 Vti1a）和 Stx8 显著抑制了 6-OHDA 刺激的 Park7 分泌。通过共免疫沉淀（co - IP）实验，使用抗 Stx8 抗体证实了 Stx3、Stx4、Sec22b 和 Vti1b 与 Stx8 共沉淀，且 6-OHDA 处理后沉淀增加。为排除非特异性相互作用，使用 Snap47 和 Hspa8 作为阴性对照，均未与目标 SNAREs 共沉淀。此外，AlphaFold2 多聚体分析也为 Sec22b - Stx3/4 - Vti1b - Stx8 复合体提供了结构支持。这些结果表明存在一个包含 Sec22b 的 QabcR - SNARE 复合体（Stx3/4、Vti1b、Stx8 和 Sec22b），可能介导 Park7 分泌到细胞外环境。
KFERQ 样基序通过 CMA 促进 PARK7 分泌
为了解 6-OHDA 诱导的 PARK7 转运到自噬泡的具体途径，研究人员探索了跨膜 P24 转运蛋白 10（TMED10）的潜在作用。有研究表明 TMED10 可促进多种无 leaderless 货物从 ERGIC 腔转运到分泌泡，但敲低 TMED10 后，PARK7 分泌增加，且不影响自噬体形成。同时，在促进自噬的 6-OHDA 处理条件下，共免疫沉淀实验未检测到 PARK7 与 LC3B 的相互作用。这些结果表明，PARK7 转运到自噬转运体可能需要其他机制。
与巨自噬不同，伴侣介导的自噬（CMA）通过 HSPA8 伴侣选择性地将带有特定氨基酸序列（KFERQ 样基序）的单个胞质蛋白直接转运到溶酶体，通过 LAMP2A 进行降解。PARK7 含有四个潜在的 CMA 基序，研究人员构建了 PARK7 的定点突变体，改变了其中三个基序的关键残基，结果发现三个突变体（91AA92、94AA95 和 44AA45）的分泌显著降低，而内源性 PARK7 和野生型 PARK7 - FLAG 变体水平不受影响，这强烈支持了 KFERQ 样基序在 PARK7 分泌中的重要性。
进一步研究 CMA 机制发现，通过 siRNA 敲低 HSPA8 或 LAMP2（CMA 的重要组成部分），显著下调了 6-OHDA 处理后的 PARK7 分泌。同时，免疫沉淀实验显示，6-OHDA 刺激下，FLAG 标记的野生型 PARK7 与 HSPA8 的相互作用增加。考虑到 PARK7 以同源二聚体形式发挥作用，而 CMA 需要未折叠的单体 PARK7 转运到溶酶体，研究人员使用共价交联剂二琥珀酰亚胺辛二酸酯（DSS）处理发现，6-OHDA 刺激下，细胞内 PARK7 主要为二聚体，而分泌的 PARK7 主要为单体形式。在 CMA 受损（HSPA8 和 LAMP2 敲低）的情况下，细胞内单体 PARK7 积累，二聚体水平变化较小。这些结果表明，PARK7 分泌倾向于单体形式，且可能涉及依赖 HSPA8 和 LAMP2 的 CMA 介导的溶酶体转运途径。
讨论
本研究揭示了 6-OHDA 诱导的 PARK7 基于自噬的非传统分泌过程中一系列独特的分子事件、选择性转运和细胞内运输过程。研究发现，6-OHDA 以自噬依赖的方式诱导 PARK7 的非传统分泌；促进胞质单体 PARK7 基于 KFERQ 样基序选择性转运到溶酶体腔；一个由 SEC22B - STX3/4 - VTI1B - STX8 组成的特定 SNARE 复合体介导含有 PARK7 的分泌自噬溶酶体与质膜的融合。
此前研究表明 6-OHDA 通过消耗细胞内谷胱甘肽水平诱导氧化应激，激活 AMPK - ULK1 途径和分泌自噬。本研究中，NAC 处理有效抑制 6-OHDA 诱导的 PARK7 分泌，证实了 6-OHDA 在 HeLa 细胞中诱导氧化应激。多项针对关键自噬调节因子的敲低和敲除实验表明，自噬膜生物发生对 PARK7 分泌至关重要，雷帕霉素激活自噬可增强 PARK7 分泌。然而，mTOR 信号在 6-OHDA 诱导的氧化应激和营养剥夺条件下，对降解性和分泌性自噬途径的调节作用仍有待进一步研究。
非传统分泌的货物进入囊泡的机制多样，本研究发现细胞外 PARK7 与外泌体无关。抑制自噬体 - 溶酶体融合或自噬通量显著下调 PARK7 分泌，且数据不支持 TMED10 依赖的 PARK7 转运到分泌泡的机制，这凸显了 PARK7 分泌的背景依赖性，以及研究不同细胞应激如何在细胞类型特异性方式下调节无 leaderless 蛋白非传统分泌的必要性。
CMA 选择性地将胞质蛋白转运到溶酶体进行降解，PARK7 序列中的 KFERQ 样基序使其可能通过 CMA 途径分泌。对 PARK7 中 KFERQ 样基序的定点突变抑制了其分泌，表明 CMA 介导的降解与 PARK7 在应激条件下的非传统分泌之间存在有趣的联系。氧化应激可能破坏 PARK7 同源二聚体，暴露 KFERQ 样基序促进 HSPA8 结合和 LAMP2 依赖的转运，但也不能排除其他导致 PARK7 单体化的机制。
目前仍不清楚为什么增加的自噬通量对 PARK7 分泌至关重要，尽管 CMA 促进其转运到溶酶体腔。一种可能是 6-OHDA 诱导的自噬通量支持自噬体和自噬溶酶体的形成，为 PARK7 分泌提供所需的自噬机制；另一种可能是自噬通量通过 6-OHDA 调节的应激信号通路促进自噬与 CMA 之间
