揭秘糖酵解烯醇化酶在竹花叶病毒复制中的关键作用：连接叶绿体与线粒体的 “桥梁”

本文聚焦竹花叶病毒（BaMV），发现糖酵解烯醇化酶（ENO）可结合 BaMV RNA 非翻译区，其结构完整性对病毒复制至关重要。ENO、丙酮酸激酶（PYK）和电压依赖性阴离子通道（VDAC）共定位于 BaMV 复制复合物，或为病毒复制提供关键支持。

　　

竹花叶病毒研究背景

病毒作为专性寄生虫，常借助宿主细胞的内部膜结构、代谢资源等完成自身的复制与传播。不同的单链 RNA 病毒会利用宿主细胞的各种细胞器或膜系统，如内质网（ER）、线粒体、叶绿体等，形成病毒复制细胞器（VRO）或病毒复制复合物（VRC） ，以保证高效复制。在这个过程中，病毒会招募多种宿主因子（HFs），这些因子来自不同细胞器，且 VRC 的组成和形态会随病毒复制和细胞内运动而变化。

竹花叶病毒（BaMV）属于阿尔法弯曲病毒科（Alphaflexiviridae）的马铃薯 X 病毒属（Potexvirus），其基因组包含五个开放阅读框（ORFs） ，分别编码具有不同功能的蛋白，如复制酶（Rep_BaMV）、运动蛋白（TGBps）和衣壳蛋白（CP）等。已有研究表明，BaMV 的复制与叶绿体密切相关，它会劫持叶绿体相关蛋白，如磷酸甘油酸激酶（chPGK）用于病毒 RNA 向叶绿体的靶向运输，以及类囊体驻留的光系统 II 放氧复合物蛋白（PsbO1）用于亚基因组 RNA 转录。同时，BaMV 的复制还与线粒体有关，其复制复合物中包含线粒体外膜蛋白电压依赖性阴离子通道（VDAC）。

研究发现烯醇化酶与 BaMV 的关联

在本研究中，研究人员以 BaMV 的 5′非翻译区（UTR）为探针，通过体外转录融合链霉亲和素结合适配体（StreptoTag） ，从烟草（Nicotiana benthamiana）原生质体粗提物中分离宿主 RNA 结合蛋白（RBPs）。经 SDS-PAGE 分离、银染和液相色谱 - 质谱（LC/MS）分析，除了已知与 BaMV 3′ UTR 结合的宿主因子外，还检测到烯醇化酶（ENO）和磷酸甘油酸变位酶（PGM）。

为进一步验证 ENO 与 BaMV 5′ UTR 的结合能力，研究人员进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）。结果显示，纯化的重组 ENO（rENO）能与³²P 标记的 BaMV 5′和 3′ UTR 结合，产生条带迁移，且对 BaMV 5′ UTR 的结合亲和力高于 BaMV 和黄瓜花叶病毒（CMV）的 3′ UTR，而与 CMV 的 5′ UTR 几乎不结合。这表明 rENO 对 BaMV 的 UTR 具有特异性结合能力。

此外，研究人员通过共免疫沉淀实验发现，ENO 能与 Rep_BaMV相互作用。在能支持卫星 RNA（satBaMV）复制的 Rep_BaMV转基因烟草叶片的 P30 组分（一种部分纯化的膜结合组分，具有支持 BaMV 及其卫星 RNA 体外复制的能力）中，用 ENO 抗体进行免疫沉淀，可检测到 Rep_BaMV，而在野生型烟草叶片中则检测不到。这说明 ENO 与 Rep_BaMV的相互作用主要发生在 BaMV 的复制体系中。

ENO 对 BaMV 复制的重要性

为探究 ENO 对 BaMV 复制的影响，研究人员利用烟草脆裂病毒（TRV）介导的病毒诱导基因沉默（VIGS）技术，在烟草中敲低 ENO 的表达。以 GFP 基因沉默作为对照，在 7 天后收获沉默植株的系统叶制备原生质体。反转录定量 PCR（RT-qPCR）结果显示，ENO 沉默的原生质体中 ENO 的表达量相较于 GFP 沉默的原生质体降低了 80%。

随后，用 BaMV 感染 GFP 和 ENO 沉默的原生质体，并在接种后 24 小时收获。RNA 印迹分析表明，ENO 沉默的原生质体中 BaMV 的基因组 RNA 和两个亚基因组 RNA（sgRNA1 和 sgRNA2）水平显著降低，仅为 GFP 沉默原生质体的 20%。这初步证明了 ENO 对 BaMV 复制具有重要作用。

研究人员进一步评估 ENO 是否为 RNA 病毒复制的通用调节因子。他们用另一种马铃薯 X 病毒（PVX）以及烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）分别感染 GFP 和 ENO 沉默的原生质体。结果发现，ENO 沉默使 PVX 的水平降低了约 60%，而对 TMV 和 CMV 的积累没有明显影响。这表明 ENO 对病毒复制的调节作用具有特异性，主要影响马铃薯 X 病毒属的病毒复制。

为进一步确认 ENO 在 BaMV 复制中的作用，研究人员进行了 ENO 过表达实验。将过表达 GFP 或 ENO-HA 融合蛋白的载体与 BaMV 的感染性克隆 pKB 共浸润烟草叶片。3 天后，通过蛋白质印迹检测到过表达的 ENO-HA，且 RNA 印迹分析显示，ENO-HA 过表达的叶片中 BaMV 的水平比 GFP 表达的叶片增加了约 1.5 倍。这些结果充分证明了 ENO 是促进 BaMV 复制所必需的。

ENO 的酶活性与 BaMV 复制的关系

ENO 在糖酵解途径中催化 2 - 磷酸甘油酸（2-PG）与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的可逆转化，它以同源二聚体的形式发挥作用。研究人员通过比较烟草的 ENO 与向日葵的 ENO，预测了对 ENO 活性重要的氨基酸残基，并进行定点突变，构建了相应的突变体，如 ENO S42A（Mg²⁺结合结构域突变）、ENO H380A（底物结合结构域突变）和 ENO TM（Mg²⁺结合、底物结合和二聚体形成缺陷的三重突变体）。

通过烯醇化酶活性测定，发现纯化的 rENO H380A 突变蛋白的活性约为野生型 rENO 的 45%，而 rENO S42A 和 rENO TM 则完全丧失酶活性。

为研究 ENO 酶活性对 BaMV 复制的影响，研究人员构建了表达野生型或活性缺陷型 ENO 突变蛋白（C 端融合 HA 标签）的二元载体，进行互补实验。将携带 BaMV 和野生型或突变型 ENO 的农杆菌以 1:1 的比例混合，浸润 GFP 和 ENO 沉默 7 天的叶片。蛋白质印迹显示，ENO 沉默确实降低了 ENO 蛋白的水平。在沉默 ENO 的叶片中，BaMV 的水平大幅下降。然而，瞬时表达野生型 ENO 可使 BaMV 水平在 7 天后恢复至约 75%，而 ENO S42A 和 ENO H380A 分别部分恢复至 59% 和 46%，ENO TM 则几乎不能恢复 BaMV 水平。这表明 ENO 在 BaMV 复制中的作用与其酶活性相关，但非功能性的 ENO（如 ENO S42A）在一定程度上也有助于 BaMV 复制。

ENO 与 Rep_BaMV相互作用的机制

虽然 ENO TM 突变蛋白无法互补 BaMV 复制，但它与 BaMV RNA 的结合活性与野生型 ENO 相似。为探究 ENO TM 无法互补复制的原因是否是其影响了与 Rep_BaMV的相互作用，研究人员进行了比例双分子荧光互补（rBiFC）实验。

在共聚焦显微镜下观察，在未感染 BaMV 的情况下，携带 pBiFCt-2in1-CN（ENO/Rep_BaMV）的农杆菌浸润烟草叶片后，在细胞质中可观察到 YFP 信号，表明野生型 ENO 能在无 BaMV RNA 的情况下直接与 Rep_BaMV相互作用。感染 BaMV 后，在细胞周边还观察到一些小的点状信号，部分与叶绿体相关。而表达 pBiFCt-2in1-CN（ENO TM/Rep_BaMV）的叶片中则没有 YFP 信号，说明 TM 突变体丧失了与 Rep_BaMV相互作用的能力。

为进一步研究这种相互作用与 ENO 酶活性的关系，研究人员用 Mg 结合突变体（S42A）进行 rBiFC 实验。结果显示，表达 pBiFCt-2in1-CN（ENO S42A/Rep_BaMV）的叶片中可检测到 YFP 信号，且通过共免疫沉淀实验也证实了 ENO WT 和 ENO S42A 都能与 Rep_BaMV-HA 相互作用，且 ENO S42A 与 Rep_BaMV的结合能力与野生型 ENO 相当。这表明 ENO 的酶活性不是其与 Rep_BaMV直接相互作用所必需的，但 ENO 的结构完整性对这种相互作用至关重要。

BaMV 复制复合物与相关蛋白的定位

在 BaMV 感染过程中，病毒会劫持多种蛋白，其复制与叶绿体和线粒体密切相关。为探究线粒体和叶绿体与 BaMV VRC 的物理关联，研究人员采用来自 flock house virus 的双链 RNA（dsRNA）结合蛋白 B2 作为 VRC 的指示蛋白，在未感染和感染 BaMV 的烟草中瞬时过表达 mito-GFP 和 B2-OFP。

在未处理的植物中，B2-OFP 仅存在于细胞核内，线粒体和叶绿体在细胞质中随机分布，部分线粒体在细胞核周围聚集，偶尔与叶绿体相关。而在感染 BaMV 的植物中，观察到大量细胞质中的 B2-OFP 聚集，且部分与线粒体和叶绿体紧密相关。这表明 BaMV 感染诱导了细胞质中 BaMV VRC 聚集的形成，且与线粒体聚集和叶绿体紧密相连，说明这两种细胞器及其相关蛋白对 BaMV 复制至关重要。

近期研究表明，叶绿体和线粒体之间的通讯依赖于糖酵解和细胞质中的 PGM-ENO-PYK-VDAC 代谢物。其中，ENO 和 VDAC 都是 BaMV 复制的重要宿主因子。研究人员瞬时过表达 ENO-DsRed 和 VDAC-GFP，发现未感染 BaMV 时，ENO 与过表达的 VDAC 聚集在细胞核周围；感染 BaMV 3 天后，这些聚集物则定位在叶绿体附近。

为验证这些 BaMV 诱导的 ENO-VDAC 聚集物与 BaMV VRC 相关，研究人员采用噬菌体 MS2 标记系统标记 BaMV 病毒 RNA，并结合 B2 dsRNA 标记系统，在体内可视化 BaMV 病毒 RNA 和复制中的 dsRNA。结果显示，在感染 MS2 标记的 BaMV 的植物中，MS2_FD-GFP 与 ENO-CFP 形成大的聚集物，部分浓缩的 B2-OFP 信号嵌入其中，且附近有少量叶绿体。通过 3D 建模更清晰地展示了 B2-OFP 信号被 MS2_FD-GFP 信号包围，部分 B2-OFP 信号穿透叶绿体包膜。这证明了 ENO、VDAC 和叶绿体都参与了 BaMV VRC 聚集。

考虑到 ENO 的酶活性对 BaMV 复制很重要，研究人员用 ENOblock（一种非底物类似物烯醇化酶抑制剂）处理叶片，发现处理后的叶片中 BaMV VRC 聚集物的大小和 BaMV 滴度均显著降低，表明 ENO 的酶活性对 BaMV VRC 的建立和高效复制至关重要。

此外，研究人员还研究了 PGM-ENO-PYK-VDAC 代谢物中的另一个成员丙酮酸激酶（PYK）是否也存在于 BaMV VRC 中。他们在未感染或感染 BaMV 的 B2-GFP 转基因烟草中瞬时过表达 CFP-PYK 和 ENO-DsRed，结果显示，未感染时，B2-GFP 主要定位于细胞核，PYK 和 ENO 在细胞质中共定位；感染 BaMV 后，细胞质中出现大量 B2-GFP 聚集物，与 CFP-PYK 和 ENO-DsRed 信号共定位，且靠近叶绿体。这些结果表明，负责叶绿体 - 线粒体关联的 ENO、PYK 和 VDAC 共定位于细胞质中的 BaMV VRC 聚集物中，且 ENO 的活性在 BaMV VRC 聚集物的形成中起关键作用。

BaMV 复制复合物包含运动复合物

BaMV 感染会产生细胞质中的 BaMV VRC 聚集物，其中包含 ER 定位的 ENO-PYK-VDAC 和 Rep_BaMV-TGBp1-VDAC-CP。由于 BaMV 的运动复合物（包含三个 TGBps 和 CP）靶向 ER，研究人员推测 ER 定位的 BaMV VRC 可能也包含 BaMV 的运动蛋白（MPs）和 CP。

他们将携带 pKB 或 pKn 的农杆菌与分别表达 ER-CFP 和 TGBp1-mCherry、TGBp2-mCherry、mCherry-TGBp3 或 CP-mCherry 的载体共浸润 B2-GFP 转基因烟草。结果发现，未感染 BaMV 时，TGBp1-mCherry 在细胞核和细胞质中均有定位，感染后主要与 ER 膜内的 BaMV VRC 共定位，细胞核中则检测不到其信号；ER 定位的 TGBp2 在未感染时在 ER 中有小颗粒，感染后出现在 BaMV VRC 的卷积 ER 膜上；mCherry-TGBp3 在未感染时在 ER 网络中形成小颗粒，感染后部分聚集在与 ER 膜相关的 BaMV VRC 中；CP-mCherry 在未感染时定位于细胞质，感染后在 BaMV VRC 中富集，少量在细胞质中。这些结果表明，细胞质中的 BaMV VRC 聚集物（包含病毒 RNA - Rep_BaMV-ENO-PYK-VDAC-TGBps-CP）在感染过程中可能利用 ER 膜进行细胞内运输。

研究总结与展望

本研究揭示了 ENO 在 BaMV 复制中的重要作用。ENO 作为一种 RNA 结合蛋白，特异性结合 BaMV 的 UTR，对 BaMV 复制至关重要，且其酶活性增强了这种作用。ENO 与 Rep_BaMV直接相互作用，这种相互作用依赖于 ENO 的二聚化而非酶活性。BaMV 劫持 ENO-PYK-VDAC 代谢物进入 VRC 聚集物，促进病毒复制，ENO 的酶活性还影响 VRC 聚集物的大小和 BaMV 的积累。

与番茄布什 y 病毒（TBSV）不同，BaMV 的复制需要来自叶绿体和线粒体的宿主因子，ENO 在 BaMV 复制中的作用可能涉及维持糖酵解代谢物，动态连接叶绿体和线粒体。虽然 TBSV 中糖酵解酶为病毒复制提供快速能量供应，但在 BaMV 中，这种能量供应和细胞器连接的作用并非相互排斥，还需进一步研究明确 ENO 和其他糖酵解酶在提供快速 ATP 供应方面的具体作用。

此外，研究人员用 ENOblock 抑制 ENO 功能，发现细胞质中 BaMV VRC 聚集物的大小和 BaMV 滴度显著降低，表明抑制 ENO 功能会破坏代谢物的酶功能，影响能量供应，进而限制细胞质 VRC 的建立和 BaMV 的积累。同时，研究还发现 ENO 与 Rep_BaMV的相互作用位点在 BaMV 感染后发生改变，从均匀分布在细胞质转变为形成点状，部分靠近叶绿体，说明这种相互作用在 BaMV 复制过程中集中在 VRC。虽然 ENO 与 BaMV UTR 的结合可能稳定 VRC 中与 Rep_BaMV相关的核糖核蛋白，但这种结合与糖酵解代谢物的建立可能无关，且 ENO 在 BaMV 复制中的积极作用不能仅由其与 UTR 的结合来解释。

总体而言，本研究为理解 BaMV 的复制机制提供了新的视角，但仍有许多问题有待进一步探索，如 ENO 和其他糖酵解酶在能量供应方面的具体机制，以及它们与其他宿主因子之间的复杂相互作用等，这将有助于深入了解病毒与宿主的相互关系，为开发新的抗病毒策略提供理论依据。