METTL3：介导动脉粥样硬化易感性血流诱导的内皮细胞糖酵解，为心血管疾病防治提供新靶点

本文研究发现，动脉粥样硬化易感性血流（如振荡切应力 OS）可通过上调甲基转移酶 3（METTL3），促进关键糖酵解基因的 m6A 甲基化，进而增加内皮细胞糖酵解，引发内皮功能障碍和动脉粥样硬化。而钠 - 葡萄糖协同转运蛋白 2 抑制剂（SGLT2i）可抑制 METTL3，减少糖酵解。这一成果为心血管疾病防治提供新方向。

　　

研究背景

动脉粥样硬化是一种严重威胁人类健康的心血管疾病。动脉粥样硬化易感性血流诱导的内皮细胞（EC）功能障碍在其发生发展中起着关键作用。在体内和体外，这种血流模式会引发 EC 的代谢重编程，促使糖酵解相关基因表达改变。例如，己糖激酶（HKs）和 6 - 磷酸果糖 - 2 - 激酶 / 果糖 - 2,6 - 二磷酸酶 3（PFKFB3）等基因表达上调，而葡萄糖激酶调节蛋白（GCKR）表达受抑制，最终导致糖酵解增加，满足 EC 促炎和增殖表型的能量需求，但这种类似 Warburg 效应的糖酵解增加却会导致 EC 功能障碍，进而引发动脉粥样硬化。

同时，RNA 修饰作为调控基因表达的关键机制逐渐受到关注。N⁶- 甲基腺苷（m⁶A）是真核生物中最丰富的 RNA 转录后修饰，由 m⁶A 甲基转移酶（如甲基转移酶 3，METTL3）、结合蛋白和去甲基酶等共同调控。已有研究表明，m⁶A RNA 修饰广泛参与 EC 生物学过程和疾病发生，且 METTL3 在多种细胞功能和疾病进程中发挥作用，包括糖酵解，但它是否参与 OS 诱导的 EC 糖酵解尚不清楚。此外，心血管药物如钠 - 葡萄糖协同转运蛋白 2 抑制剂（SGLT2i）对 EC 糖酵解的抑制作用是否通过 METTL3 调节的转录组介导也有待研究。

研究结果

1. OS 通过 METTL3 增加糖酵解：研究人员分析 RNA - seq 数据和单细胞 RNA - seq（scRNA - seq）数据集发现，与脉动切应力（PS，具有动脉粥样硬化保护作用的血流）相比，振荡切应力（OS，动脉粥样硬化易感性血流）可上调大多数糖酵解相关酶基因的表达。敲低 METTL3 后，OS 升高的细胞外酸化率（ECAR）和乳酸水平显著降低，恢复到与 PS 处理的 EC 相似水平。同时，OS 上调的 HK1 和 PFKFB3 的 mRNA 和蛋白水平因 METTL3 敲低而被抑制，而 OS 抑制的 GCKR 水平则被逆转。这表明 OS 增强的 EC 糖酵解是通过 METTL3 对 HK1、PFKFB3 和 GCKR 的调节实现的。
2. 剪切应力通过 m⁶A 修饰调节糖酵解基因：通过挖掘已发表的 eCLIP - seq 数据，研究人员证实 OS 可诱导 HK1、PFKFB3 和 GCKR 的 m⁶A 修饰。利用 SRAMP 算法预测这些基因 mRNA 的 3’非翻译区（3’UTR）高置信度 m⁶A 位点，并通过 m⁶A - RNA 免疫沉淀（m⁶A - RNA - IP）qPCR 实验验证，发现 OS 可富集这些基因 3’UTR 的 m⁶A 修饰，且该修饰可被 METTL3 敲低所减弱。过表达野生型 METTL3 可增加这些基因的 m⁶A 修饰，伴随 HK1 和 PFKFB3 表达增加、GCKR 表达降低；而过表达 m⁶A 去甲基酶 FTO 则抑制 OS 上调的 HK1 和 PFKFB3，逆转 OS 下调的 GCKR。这些结果表明，剪切应力对 HK、PFKFB3 和 GCKR 的调节是通过 METTL3 介导的 m⁶A 修饰实现的。
3. SGLT2i 通过抑制 METTL3 减少 EC 糖酵解：用恩格列净（EMPA，一种 SGLT2i）处理 EC 后，METTL3 蛋白水平显著降低，但 mRNA 水平变化不大。同时，HK1 和 PFKFB3 表达减少，GCKR 表达增加。功能实验表明，EMPA 降低 EC 糖酵解，而 METTL3 过表达可逆转这一作用。这说明 SGLT2i（如 EMPA）可通过下调 METTL3 来减弱 EC 糖酵解。
4. OS 通过 METTL3 诱导葡萄糖摄取：研究人员以小鼠主动脉弓（AA）和胸主动脉（TA）内膜分别代表动脉粥样硬化易感性和保护性血流区域，qPCR 分析发现 AA 内膜中 METTL3、Hk1 和 Pfkfb3 的 mRNA 水平高于 TA 内膜，而 Gckr 水平则相反。在 EC - METTL3^?/?小鼠中，这些基因的表达水平与野生型（WT）小鼠相比发生逆转，表明 METTL3 在体内介导动脉粥样硬化易感性血流诱导的糖酵解。
5. SRS 成像分析体内外葡萄糖代谢：用 D7 - 葡萄糖（D7 - glu）标记 ECs 并进行刺激拉曼散射（SRS）成像分析，结果显示 OS 处理的 ECs 中 CD 信号（代表新合成的脂质来源于摄取的 D7 - glu）显著升高，敲低 METTL3 可消除这一升高；过表达 METTL3 则使 PS 处理的 ECs 中 CD 信号增加。对喂食含 3% D7 - glu 水 2 周的 EC - METTL3^?/?小鼠和 WT 小鼠进行体内 SRS 成像，发现动脉粥样硬化易感性 AA 区域的 CD/CH 比值（反映 D7 - glu 掺入新合成脂质的情况）和 NADH / 黄素比值（反映分解代谢情况）均高于动脉粥样硬化保护性 TA 区域，但在 METTL3 敲除小鼠中这些代谢升高现象受到抑制。这表明动脉粥样硬化易感性血流通过 METTL3 介导的机制在体内外升高葡萄糖摄取和代谢。

研究讨论

血流紊乱通过增加糖酵解显著影响 EC 功能。在多种疾病状态下，EC 会发生代谢转变，出现类似 Warburg 效应的糖酵解增强现象，这会导致 EC 功能障碍，其机制包括破坏能量代谢、产生酸性代谢产物和活性氧物种引发氧化应激、损害一氧化氮生成并降低其生物利用度以及激活炎症通路等，还与内皮 - 间充质转化相关，促进血管僵硬和纤维化。

HK1 和 PFKFB3 作为糖酵解早期的关键限速酶，在 EC 功能障碍中起重要作用。不同血流条件可对其进行差异调节，PS 可通过 KLF2 抑制 PFKFB3 来降低糖酵解，而 OS 和缺氧则可通过 HIF - 1α 诱导 HK1 和 PFKFB3 增加糖酵解。GCKR 可通过与 HK1 结合抑制糖酵解，PS 可上调 GCKR 从而抑制糖酵解，而本研究发现 OS 可通过 METTL3 下调 GCKR。因此，METTL3 通过转录后调控在 EC 机械转导与代谢重编程之间发挥关键连接作用。

本研究还揭示了 SGLT2i 抑制 METTL3 以减少 EC 糖酵解的作用。SGLT2i 通过抑制肾脏中的 SGLT2 降低血糖水平，改变葡萄糖可用性和能量代谢，减少肝脏和骨骼肌中可用于糖酵解的葡萄糖量，促使机体更多依赖脂肪酸和酮体等替代能源，从而调节代谢平衡远离糖酵解。但 EMPA 调节 METTL3 蛋白的具体机制尚不清楚，可能与翻译后修饰（如泛素化）有关。

综上所述，本研究揭示了动脉粥样硬化易感性血流通过诱导 METTL3 促进 EC 糖酵解，而动脉粥样硬化保护性血流和 SGLT2i 则通过抑制 METTL3 - m⁶A 对 HK1、PFKFB3 和 GCKR 的修饰来抑制糖酵解。这些发现将转录后状态与代谢调节相联系，增进了人们对 EC 在健康和疾病状态下生物学特性的理解，为心血管疾病的防治提供了新的潜在靶点和理论依据。

材料和方法

1. 动物：动物实验经加利福尼亚大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会批准。通过将纯合的 floxed METTL3 小鼠（METTL3^flox/flox）与 VE - Cadherin Cre 小鼠在 C57BL/6 背景下杂交，获得内皮细胞特异性 METTL3 敲除小鼠。选用 8 - 10 周龄的雄性 EC - METTL3^?/?小鼠及其 WT 同窝小鼠进行实验。
2. 细胞培养和转染：人脐静脉内皮细胞（HUVECs）购自 Cell Applications，在添加多种成分的 M199 培养基中培养，选用 4 - 6 代的 ECs 进行后续实验。质粒通过电穿孔转染，使用特定程序和设备；siRNA 转染则利用 Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂将 METTL3 siRNA 或对照 RNA 转染到 HUVECs 中。
3. 血流实验：利用循环血流系统和平行板流动小室，对 HUVECs 施加脉动切应力（PS，12 ± 4 dyn/cm²）或振荡切应力（OS，0.5 ± 4 dyn/cm²），实验过程保持特定温度和气体环境。
4. qPCR：使用 RIzol 试剂从培养的 ECs 或小鼠 AA 和 TA 内膜中提取总 RNA，逆转录为 cDNA 后，利用 SYBR Green 实时 PCR 预混液在特定检测系统上进行实时 PCR。采用 2^-??Ct方法计算结果，并将 mRNA 表达水平归一化到 β - 肌动蛋白表达。所用引物信息列于相关补充材料。
5. Western blot：用含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液裂解 ECs 或血管内膜组织，定量蛋白质浓度后，通过 SDS - PAGE 分离蛋白质并转移到 PVDF 膜上，依次与特定的一抗和二抗孵育，利用 ECL 系统显影检测蛋白条带。使用的一抗包括 METTL3、HK1、PFKFB3、GCKR 和 β - 肌动蛋白等相关抗体。
6. ECAR 检测：将 ECs 以特定密度接种到 Seahorse XF96 细胞培养微孔板中，分别在静态和血流实验中孵育不同时间。更换培养基后在非 CO₂培养箱中平衡 1 小时，然后用 Seahorse XF96 细胞外通量分析仪测量 ECAR。依次添加葡萄糖、寡霉素 A 和 2 - 脱氧 - D - 葡萄糖，以检测糖酵解相关指标。
7. 乳酸检测：按照 L - 乳酸检测试剂盒说明书，对细胞裂解物中的乳酸浓度进行检测。在 96 孔微孔板中依次加入样本、检测缓冲液、辅酶制备液、酶混合液和染料试剂，反应后在特定波长下测量吸光度，通过标准曲线计算样本中的乳酸浓度。
8. m⁶A - IP 和 qPCR：按照之前描述的方法进行 m⁶A - IP 实验。先对 RNA 样本进行片段化处理，然后与 Dynabeads Protein G 和 m⁶A 抗体孵育，经过多次洗涤后洗脱甲基化 RNA，再进行 RNA 分离和定量分析。
9. SRS 成像：体外 SRS 成像时，HUVECs 先在含 25 mM D7 - glu 的培养基中培养 72 小时进行代谢标记，然后在含相同浓度 D7 - glu 的培养基中分别接受 OS 或 PS 处理 48 小时。体内 SRS 成像时，C57BL/6 小鼠喂食 3% D7 - glu 水 2 周。标记后，获取细胞和组织的 SRS 图像，分析特定信号峰以检测葡萄糖代谢变化和脂质周转率，使用 ImageJ 软件对图像进行处理和定量分析。
10. 统计分析：所有数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。对于正态分布的数据，两组间比较使用双侧 Student's t 检验；对于偏态分布的数据，使用非参数检验（Mann - Whitney U 检验）。多组间比较根据方差情况使用单因素方差分析（ANOVA）结合 Bonferroni 事后检验或 Tamhane’s T2 检验。使用统计软件进行分析，P 值小于 0.05 认为具有统计学意义。