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登革病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）主要由伊蚊传播，过往研究多聚焦埃及伊蚊和白纹伊蚊，忽视其他伊蚊。本研究发现盾纹伊蚊虽初始感染率低，但感染后能高效复制并传播病毒，与埃及伊蚊相当，警示需重视这类被忽视的媒介物种。
1. 研究背景
登革热和寨卡感染均由节肢动物传播的正黄病毒（arbo - orthoflaviviruses）引起。登革病毒每年在全球造成约 100 - 400 万例感染，严重时可引发登革出血热和登革休克综合征；寨卡病毒在 2015 年因在美洲热带和亚热带国家迅速传播，且与新生儿神经系统症状和先天性畸形相关而备受关注。这两种病毒主要通过感染的伊蚊叮咬传播。
目前大多数关于登革病毒和寨卡病毒传播的研究主要集中在埃及伊蚊（Ae. aegypti）和白纹伊蚊（Ae. albopictus），而其他伊蚊物种大多被忽视。随着气候变化，虫媒病毒媒介可能会在地理上扩散，包括那些被忽视的蚊子物种，它们可能带来未知的病毒传播风险。此外，一些物种特异性干预措施，如基因驱动和沃尔巴克氏体（Wolbachia），可能会导致主要媒介种群结构的显著变化，从而为被忽视的媒介提供生态空间。
盾纹伊蚊（Ae. scutellaris）所属的盾纹伊蚊组包含 46 种以上的物种，地理范围覆盖东南亚、南太平洋和澳大利亚北部。盾纹伊蚊被认为是巴布亚新几内亚登革病毒的潜在携带者，并可能在太平洋岛屿的登革病毒传播中起主要作用。然而，尽管有研究表明盾纹伊蚊在登革病毒传播中的作用，但对其传播能力的研究较少，且以往研究存在局限性，如未评估病毒从唾液腺逃逸到蚊子唾液中的感染阶段的能力等。因此，本研究旨在详细分析盾纹伊蚊对登革病毒 1 - 4 型（DENV1 - 4）和寨卡病毒（ZIKV）的感染动力学，以确定其媒介能力，并与埃及伊蚊和白纹伊蚊进行比较。
2. 材料和方法
- 伦理声明：本研究遵循曼谷玛希隆大学热带医学学院动物护理和使用委员会（FTM - ACUC）以及泰国国家科学技术发展署生物技术实验室动物护理和使用委员会（BIOTEC - IACUC）的规定。蚊子收集、饲养以及感染实验均按照批准的方案进行，使用人类志愿者血液也经过相关机构审查委员会批准，并获得志愿者书面同意。
- 盾纹伊蚊的饲养：2022 年 11 月至 2023 年 1 月，从泰国北柳府邦巴功区松克隆分区沿海地区收集盾纹伊蚊幼虫，在实验室饲养至成虫，通过形态学观察和基于细胞色素氧化酶 I（COI）基因的 PCR 分子鉴定确认物种，选取低代次（少于 6 代）的盾纹伊蚊用于感染实验。
- 蚊子种群及饲养：使用新饲养的盾纹伊蚊以及实验室品系埃及伊蚊（DMSC 品系）和白纹伊蚊（TH 品系）进行感染研究。这些蚊子在 BIOTEC 昆虫饲养室中饲养，保持温度 27°C、湿度 80%，光照周期为 12 小时光照、12 小时黑暗，并有 30 分钟的黄昏和黎明过渡。幼虫喂食粉状鱼食，成虫自由取食 10% 蔗糖溶液，通过让蚊子叮咬麻醉的 ICR 小鼠获取用于种群维持的卵。
- 病毒培养和滴定：感染研究使用泰国 ZIKV 分离株 SV0010/15 和来自 BEI Resources 的当代登革病毒 1 - 4 型面板（包括登革病毒 1 型 UIS 998、2 型 US/BID - V594/2006、3 型 US/BID - V1043/2006 和 4 型 UIS 497）。病毒在白纹伊蚊细胞系 C6/36 中培养，培养至细胞 80% 汇合后接种病毒，孵育后收集上清液并储存。病毒滴度通过在 BHK - 21 细胞上的空斑试验测定。
- 人工膜饲血感染蚊子：使用 Hemotek 人工膜饲血系统，让 7 日龄雌性蚊子禁食 6 小时后，喂食含有 40% 人类红细胞、病毒原液（约 6 Log10 PFU/mL）的人工感染血餐 30 分钟。喂食后筛选饱血雌蚊，在特定条件下饲养，用于后续组织收集。
- 血餐大小的估计：通过量化血红素含量估计血餐大小。收集饱血蚊子，用玻璃珠匀浆后离心，取上清液使用血红素检测试剂盒测定血红素含量。同时制备标准曲线，通过标准曲线插值计算每只蚊子的血餐大小。
- 胸腔注射感染蚊子：使用纳米注射器将 100 nL 病毒原液（约 6 Log10 PFU/mL）注射到 4 - 7 日龄冷麻醉的雌性蚊子胸腔内，注射后蚊子在特定条件下饲养。
- 蚊子解剖和唾液收集测定：蚊子冷麻醉后表面消毒，解剖收集其中肠、 carcass 和唾液腺，储存用于空斑试验滴定。按照已发表的方案收集蚊子唾液，立即进行空斑试验滴定。
- 通过 wsp 基因检测 Wolbachia：提取蚊子全基因组 DNA，使用特定引物和 Luna Universal qPCR master mix 进行 PCR 检测 Wolbachia 的 wsp 基因，以埃及伊蚊和致倦库蚊基因组 DNA 为阳性对照。
- 数据分析：使用混合数据因子分析（FAMD）研究感染流行率、蚊子物种、病毒和组织类型之间的关系。使用 rstatix 包在 R 软件中进行统计分析，多组比较采用 Kruskal - Wallis 检验和 Dunn 氏事后检验，使用 ggpubr 包绘制图表。
3. 研究结果
- 盾纹伊蚊的感染特性：盾纹伊蚊成功饲养并经分子鉴定确认，且该种群不含 Wolbachia。通过人工膜饲血实验发现，盾纹伊蚊中肠总体感染率最低（中位数为 50%），低于白纹伊蚊（58.3%）和埃及伊蚊（100%），这可能与血餐大小有关，盾纹伊蚊血餐量为 1.6 ± 0.6 μL，小于白纹伊蚊（2.5 ± 0.7 μL）和埃及伊蚊（3.0 ± 0.4 μL）。尽管盾纹伊蚊血餐小，但中肠感染率与白纹伊蚊相似，表明其可能更易感染。在唾液腺中，埃及伊蚊感染率最高（75%），白纹伊蚊（43.75%）次之，盾纹伊蚊（25%）最低。然而，盾纹伊蚊与埃及伊蚊的病毒传播率无显著差异（分别为 11.1% 和 8.3%），说明盾纹伊蚊唾液腺逃逸屏障较低。
- 病毒遗传学对感染的影响：通过 FAMD 聚类分析发现，ZIKV、DENV1 和 DENV3 聚类在一起，DENV2 和 DENV4 形成不同的组。ZIKV 和 DENV3 在中肠感染率最高，DENV2 最低。在后续感染阶段，ZIKV 在所有组织中的感染率最高。不同 DENV 血清型感染特性各异，DENV3 中肠感染率高，但后续感染屏障较高；DENV2 中肠感染率低，但后续感染屏障低，最终传播率与 DENV1 相似。这些结果表明组织特异性感染表型很大程度上由病毒遗传学决定。
- 伊蚊组织对病毒复制的支持：研究发现三种伊蚊组织都能支持高水平的病毒复制。盾纹伊蚊中肠对 DENV1、DENV2 和 DENV4 的复制水平与埃及伊蚊相似，尽管其血餐小。在后续感染阶段，盾纹伊蚊在某些病毒（如 DENV1）的复制上表现出与埃及伊蚊不同的特点。三种伊蚊感染唾液腺的病毒滴度无统计学差异，表明病毒一旦感染，能在盾纹伊蚊唾液腺中有效复制。
- 唾液病毒载量的影响因素：在唾液中可检测到病毒的蚊子中，埃及伊蚊的 ZIKV 滴度与盾纹伊蚊相当，但显著高于白纹伊蚊，说明白纹伊蚊唾液腺逃逸屏障较强。不同 DENV 血清型在不同伊蚊唾液中的滴度存在差异，DENV1 在三种伊蚊唾液中滴度相当，DENV2 在埃及伊蚊和盾纹伊蚊中相似，但由于样本量低，部分结果需谨慎解释。
- 胸腔注射后的感染情况：由于盾纹伊蚊人工膜饲血血餐小，可能影响传播能力评估，因此进行胸腔注射实验确保等量病毒接种。FAMD 分析显示，盾纹伊蚊和埃及伊蚊感染流行率模式相似，而白纹伊蚊唾液中病毒流行率显著低于前两者，表明其唾液腺逃逸屏障更强。ZIKV 在所有组织中感染性最强，不同 DENV 血清型感染特性在胸腔注射后也有所不同，DENV1 成为最具感染性的 DENV。盾纹伊蚊在 ZIKV 和 DENV 传播上与埃及伊蚊表现相似，尽管其在某些组织中的病毒滴度较低，但唾液腺逃逸屏障低，能有效释放病毒到唾液中。
4. 研究讨论
本研究通过比较盾纹伊蚊与埃及伊蚊、白纹伊蚊对登革病毒和寨卡病毒的感染动力学，深入了解了盾纹伊蚊的媒介能力。血餐大小影响中肠感染的建立，埃及伊蚊中肠感染率高可能与大血餐量有关，但不能排除盾纹伊蚊中肠本身易感性的差异。盾纹伊蚊能支持 ZIKV 和 DENV 复制，且跨越组织边界的屏障低，在胸腔注射实验中与埃及伊蚊传播能力相当。
白纹伊蚊中肠感染建立的研究结果存在矛盾，但其唾液腺逃逸屏障可能是限制病毒传播的主要因素。不同病毒的感染动力学存在显著差异，ZIKV 感染性和传播性最强，不同 DENV 血清型感染特性不同，这受到病毒和载体基因型的影响。
本研究存在一定局限性，仅使用了每种病毒的一个毒株，可能存在蚊子和病毒基因型之间的特异性相互作用影响感染结果。未来应研究当地蚊子和病毒毒株的传播能力，并结合评估寨卡和登革热流行地区的媒介种群密度，以更全面地了解每种蚊子在当地病毒传播中的作用。泰国具备开展此类研究的条件。
考虑到气候变化，盾纹伊蚊在虫媒病毒传播和爆发中的潜在作用值得关注。现有研究对其地理分布的研究较陈旧，需要更新调查其当前分布和媒介能力的变化。此外，还需探索盾纹伊蚊组其他成员的媒介能力，以更好地了解疾病传播，制定有效的媒介控制策略。
