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本文综述了不同尺寸纳米颗粒（NP）进入三维细胞球体的穿透情况，对比了质谱、流式细胞术、光学荧光显微镜等多种实验分析技术，讨论了各技术对不同类型 NP 的局限性，为 NP - 基于药物的研发提供参考。
纳米颗粒穿透组织研究的重要性与模型选择
纳米颗粒（NP）作为未来药物载体，其向靶位点的递送至关重要。理想情况下，NP 应大量聚集在靶组织如肿瘤处，但当前递送技术远未达到这一目标。肿瘤组织结构复杂，由多种细胞构成，NP 在肿瘤内的分布情况对其治疗效果影响重大。因此，在 NP - 基于药物进入临床试验前，深入了解其穿透肿瘤核心的能力及后续分布十分关键。
体外三维（3D）肿瘤模型为研究 NP 的肿瘤穿透和分布提供了便利。其中，细胞球体因制备简单且结构与实体肿瘤相似，常被用于相关研究。不过，这些模型存在血管化问题，小分子如氧气的扩散受限，会导致细胞球体内部缺氧和营养不足，影响长期培养，且球体内部会逐渐形成坏死核心。
研究纳米颗粒穿透的实验技术
- 电感耦合等离子体质谱（ICP - MS）：ICP - MS 可精确测定细胞中特定元素的总质量浓度，尤其适用于金属元素检测。对于金属 NP，能直接检测细胞内金属质量浓度并换算成 NP 浓度。该技术可通过不同消化方案区分细胞外和细胞内的 NP，检测限低。但传统 ICP - MS 缺乏横向分辨率，无法确定 NP 在球体内的浓度变化。激光烧蚀辅助的 ICP - MS 虽能实现元素成像，但过程缓慢，难以检测整个球体。在研究不同 Au NP 在 MCF - 7 球体内的积累实验中，ICP - MS 能体现出尺寸依赖性，但无法区分黏附和内化的 NP，也无横向分辨率。不过，它可同时检测多种金属，便于进行共孵育研究，还能快速比较不同实验条件。
- 流式细胞术：流式细胞术是基于激光的技术，能快速检测单个细胞的多种特征，对荧光信号检测限低，可检测单个荧光 NP，能识别细胞亚群。在 NP 摄取研究中，通常需要荧光 NP，通过用 pH 依赖的荧光团修饰 NP 表面可区分黏附和内化的 NP，但该方法较少使用。在研究 NP 进入球体的实验中，通过用 Hoechst33342 染色球体，可创建深度依赖的染料梯度，从而对不同区域的细胞进行分类。然而，流式细胞术缺乏横向分辨率，对细胞区域的分类较粗糙，无法计数细胞外 NP，且只能提供多个球体的平均数据，难以进行单球体分析。
- 光学显微镜：光学显微镜包括荧光显微镜、暗场显微镜和共聚焦拉曼显微镜等，能为单个球体内的 NP 成像提供出色的空间分辨率。荧光显微镜可检测荧光标记或固有荧光的 NP，甚至能进行单分子成像。但在深层组织成像时，存在生物分子的自发荧光、水吸收和光散射等问题，会干扰检测，推荐使用远红或长寿命荧光团。此外，NP 的荧光还受 pH 影响，在血清培养基中可能减弱，且存在光漂白和荧光团释放等问题。
以双光子显微镜为例，其近红外光穿透性好，可直接检测大尺寸 Au NP 的双光子发光信号，无需荧光标记。但双光子成像需较高激光功率，可能对样品造成热损伤。在对固定的 MCF - 7 球体进行成像实验中，荧光显微镜能直观展示 NP 在球体内的 3D 分布，但定量分析存在困难，如球体形状不规则，难以确定表面和进行定量分析，且荧光数据与 NP 质量分布不直接相关。不过，通过选择合适的分割方法和对比不同 NP 的荧光强度，可在一定程度上分析 NP 的穿透情况。
4. X 射线荧光成像（XFI）：XFI 可对多种元素的分布进行多重成像，并能定量测量元素质量浓度。它具有元素特异性，不易受光氧化影响，检测限低，空间分辨率较高。通过检测细胞内富集元素可确定扫描边界，从而量化球体内 NP 的质量浓度分布。然而，XFI 对活样品存在辐射损伤问题，通常需对样品进行固定和脱水处理，这可能导致样品收缩和 NP 分布改变。虽然可采用冷冻固定或使用更高能量范围等方法解决部分问题，但仍存在局限性。在对 MCF - 7 球体的研究中，XFI 能确定不同 Au NP 在球体内的含量，但由于样品处理和测量时间等问题，其对 NP 分布的分析可靠性受限。不过，XFI 可用于非荧光样品分析，能扩展 NP 研究类型。
5. 透射电子显微镜（TEM）：TEM 能提供球体内细胞微观结构的超高分辨率信息，可区分细胞内外的 NP，分辨率高。但 TEM 观察视野有限，只能检测少数细胞，且对未处理的生物结构对比度低，需对样品进行染色、脱水、包埋和切片等复杂处理，可能改变样品结构。TEM 可清晰展示 NP 在球体内的分布和亚细胞定位，还能与其他技术结合获取更多信息，如与能量色散 X 射线光谱（EDX）或电子能量损失光谱（EELS）结合分析元素分布，通过电子断层扫描（ET）可重建 3D 图像。不过，ET 对样品厚度有限制，且大多数先进实验方法技术复杂或仪器昂贵。在对 MCF - 7 球体的实验中，TEM 虽能提供高分辨率图像，但成像过程耗时，难以获取足够数据进行统计分析，且难以区分同一球体内的不同电子致密 NP。
研究面临的挑战与局限
不同分析技术在研究 NP 穿透时面临诸多挑战。细胞球体形状复杂，并非完全球形，这使得定量分析困难，目前尚无方法能确定 NP 进入球体的平均穿透深度。而且，并非所有方法都适用于所有类型的 NP。例如，碳基 NP 因碳元素在细胞中广泛存在，用 ICP - MS 或 X 射线荧光显微镜进行元素分析时存在困难，其荧光在血清培养基中也可能淬灭，需进行标记处理。
NP 的性质受环境影响，如 CdSe/ZnS 量子点在生理 pH 条件下会发生荧光衰减，这使得不同分析技术的结果难以比较。此外，细胞模型系统虽可用于系统研究 NP 的尺寸依赖性效应，但存在局限性。细胞球体模型结构简单，与体内肿瘤微环境存在差异，如缺乏血管化、淋巴引流和基质成分等，无法完全模拟肿瘤情况，因此研究结果不能直接外推到体内，仍需进行体内测量，不过可先基于球体模型进行预筛选，减少动物实验数量。
