结核分枝杆菌mce1操纵子中长链脂肪酸酰基辅酶A合成酶FadD5的结构酶学研究：揭示脂质代谢关键机制

本研究针对结核分枝杆菌(Mtb)脂质代谢关键酶FadD5展开结构酶学解析，通过X射线晶体学、SAXS和酶活分析等技术，首次揭示该膜相关二聚体蛋白偏好长链脂肪酸(C12-C24)的催化特性，证实C端结构域对活性的必要性，并提出其通过N端螺旋膜锚定协助Mce1复合物转运脂质的分子机制，为抗结核药物开发提供新靶点。

　　

结核病至今仍是全球重大公共卫生威胁，每年导致超百万人死亡。结核分枝杆菌(Mtb)的独特生存能力与其复杂的脂质代谢网络密切相关，其中细胞壁富含的脂质分子不仅是结构组分，更是病原体在宿主体内获取能量的关键底物。mce1操纵子编码的哺乳动物细胞侵入(Mce)复合物被证实是分枝杆菌摄取外源脂肪酸的关键通道，但该过程后续的代谢激活机制尚不明确。尤其值得注意的是，该操纵子还编码一个功能未明的脂肪酸酰基辅酶A合成酶FadD5（Rv0166），其在感染过程中对菌体存活至关重要——敲除fadD5的Mtb突变体在小鼠模型中致病力显著减弱，暗示该酶可能成为抗结核治疗的新靶标。

为揭示FadD5的分子机制，研究人员综合运用多学科技术手段。通过X射线晶体学解析蛋白结构时发现C端结构域在结晶过程中意外断裂，遂采用AlphaFold预测模型结合小角X射线散射(SAXS)验证全酶构象。酶活实验采用Malachite Green磷酸检测法监测焦磷酸水解，LC-MS直接捕获酰基-CoA产物。膜关联特性通过差速离心和去垢剂提取分析，而构象变化则借助圆二色谱(CD)和纳米差示扫描荧光法(nanoDSF)进行表征。

3.1 序列分析显示FadD5的保守基序
FadD5具有典型酰基腺苷酸酶(AAE)家族特征：P-loop(IMYTSGTTGRPKGA)结合ATP磷酸基团，A基序(LAAFGQTE)识别腺苷环，而407-433位的特征序列GGWFHSGDLVRMDSDGYVWVVDRKKDM构成脂肪酸结合域。值得注意的是其G基序(VPLFHIAG)中疏水残基Ile²⁴⁰可能作为"分子门控"调控长链底物进入。

3.2 FadD5以二聚体形式存在并具有膜关联特性
SEC-MALLS测定显示天然FadD5为115kDa二聚体，蓝绿胶电泳验证该寡聚状态。虽然可溶性纯化获得稳定蛋白，但差速离心实验证实其能通过N端结构域与膜结合——截短C端的FadD5_1-448仍保留膜靶向能力，提示N端可能存在两亲性螺旋介导膜相互作用。

3.3 ATP增强FadD5稳定性
热变性实验揭示ATP使蛋白熔解温度(T_m)从44°C升至47°C，而CoA无此效应。nanoDSF显示ATP延迟蛋白聚集起始温度，暗示其通过结合稳定酶分子构象。

3.4 FadD5是偏好长链脂肪酸的FACS
酶活谱分析显示FadD5对C12-C24脂肪酸均有活性，其中月桂酸(C12)比活力最高(2.92 pmol mg^-1min^-1)，而棕榈酸(C16)亲和力更强(K_m=89.83 μM)。LC-MS直接检测到C12-AMP(528.2228 m/z)和C12-CoA(948.2765 m/z)产物生成。关键发现是缺失C端结构域的突变体完全丧失活性，证实该区域对催化不可或缺。

3.5 结晶过程中FadD5发生C端结构域断裂
2.8?晶体结构(PDB 8R2Q)显示不对称单元中含两个N端结构域(残基20-435)，C端在结晶过程中被蛋白酶切割。该现象与结核杆菌FadD13、FadD28的结晶行为一致，提示AAE家族C端结构域可能存在固有柔性。

3.6 C端结构域运动与SAXS研究
通过AlphaFold预测模型构建全酶二聚体(FadD5_AF)，SAXS数据拟合证实溶液中存在完整二聚体(R_g=35.5?)。比较不同构象模型发现，ATP结合使C端趋向腺苷酸化构象(FadD5_3r44)，而CoA诱导更闭合的硫酯化构象(FadD5_1ult)。

3.7 ATP和CoA结合位点特征
结构比对揭示ATP结合口袋由P-loop和A基序构成，其中保守的Glu³³⁶可能参与质子转移。CoA结合则诱发G基序(VPLFHIAG)构象变化，该区域在FadD5中具有更小的侧链(如Gly²³¹/Ala²³⁸)，可能适应更长的酰基链。

3.8 脂肪酸酰基尾结合口袋
与Thermus thermophilus FACS(1v26)比对发现，FadD5的底物通道朝向二聚体界面扩展，暗示超长链脂肪酸(如分枝菌酸)可能通过单体间空隙进入活性中心。特别值得注意的是，AlphaFold预测的N端两亲性螺旋(残基1-19)带正电荷且疏水面暴露，可能作为膜锚定模块协助底物摄取——这完美解释了为何Mce1转运的脂质需要FadD5进行后续激活。

这项研究首次系统解析了FadD5的结构功能关系，不仅证实其作为mce1操纵子"脂质代谢终端"的酶学特性，更提出创新的膜结合工作模型：Mce1复合物将环境中的长链脂肪酸转运至胞内后，FadD5通过N端螺旋锚定在膜上，利用二聚体界面形成的疏水通道接收底物，最终催化生成酰基-CoA进入β-氧化途径。该发现为理解结核杆菌脂质代谢网络提供关键拼图，其揭示的C端结构域功能必要性及特有的N端膜靶向模块，为开发选择性抑制FadD5的抗结核药物奠定理论基础。未来研究可聚焦于C端结构域的动态构象变化机制，以及如何利用二聚体界面设计阻断长链底物进入的小分子抑制剂。