甲状腺激素诱导牛蛙变态过程中，温度介导下组蛋白变化的深度剖析

两栖动物变态受甲状腺激素（TH）调控，但 TH 如何引发蝌蚪到青蛙转变所需的基因表达变化尚不明确。研究人员以牛蛙为对象，研究不同温度下 TH 处理后其组织中组蛋白及相关蛋白变化。结果发现多种蛋白和 PTM 变化具有组织和温度特异性，这有助于理解 TH 信号传导及分子记忆机制。

　　在神奇的自然界中，两栖动物的变态发育一直是生物学家们热衷探索的神秘领域。以牛蛙（Rana [Lithobates] catesbeiana）为例，从小小的蝌蚪逐渐变成能在陆地跳跃、水中畅游的青蛙，这一过程充满了奥秘。甲状腺激素（TH）在这个变态过程中扮演着至关重要的角色，它就像是一把钥匙，开启了蝌蚪身体重塑的大门，引导着整个身体从适应水生环境向适应（半）陆生环境转变。然而，科学家们发现，TH 虽然重要，但它如何精准地在不同组织和发育阶段引发特定的基因表达变化，进而实现从蝌蚪到青蛙的成功转变，仍是一个未解之谜。

不仅如此，牛蛙蝌蚪的变态还受到温度的影响。在寒冷的 5°C 环境下，即使有 TH 的存在，变态也不会发生。但令人惊奇的是，在 5°C 接触过 TH 的蝌蚪，当温度回升到 24°C 时，会加速变态，仿佛它们记住了之前 TH 的 “召唤”，这种现象被称为分子记忆。这背后的分子机制是什么呢？为了揭开这些谜团，来自加拿大维多利亚大学的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，他们选取了不同温度条件（24°C、5°C 以及 5→24°C）下的牛蛙蝌蚪进行实验。实验中，对蝌蚪进行腹腔注射 T₃（TH 的一种活性形式）或溶剂对照处理。接着，从蝌蚪的血液、肝脏和尾鳍中提取组织样本，经过一系列复杂的操作，包括组织细胞核的分离、酸提取以富集目标蛋白、蛋白质定量等。然后，运用串联质谱（MS/MS）结合串联质量标签（TMT）标记技术，对组蛋白和其他染色质相关蛋白的丰度及翻译后修饰（PTM）进行全面分析，最终深入探究在不同温度条件下 TH 处理对牛蛙组织中这些蛋白的影响。

下面让我们来看看具体的研究结果：

• SDS-PAGE 评估组蛋白质量：通过 15% SDS-PAGE 对酸提取的蛋白样本进行检测，结果显示所有样本的组蛋白条带都清晰可辨，且各条带的比例大致相当，同时没有多余的蛋白条带，这表明酸提取成功地富集了组蛋白。
• 酸提取富集组蛋白蛋白：研究人员在不同温度条件下，从牛蛙的血液、肝脏和尾鳍中总共鉴定出了一定数量的蛋白，其中大部分信号都来自组蛋白，这进一步证明了酸提取方法有效地富集了目标蛋白。
• 蛋白质注释：由于牛蛙蛋白质组注释不完全，研究人员将感兴趣的组蛋白和其他染色质相关蛋白与人类蛋白质组进行比对，以此来进行注释。
• 组织和温度特异性的蛋白丰度变化：在三种温度模式下，对 T₃处理后的牛蛙组织研究发现，血液、肝脏和尾鳍中的组蛋白和非组蛋白染色质结合蛋白的丰度都发生了变化。而且，不同组织的蛋白丰度变化具有独特性，不同温度条件下同一组织的变化也不相同。例如，在适宜温度（24°C）下，肝脏中变化的蛋白数量最多；在非适宜温度（5°C）下，肝脏是唯一有显著组蛋白丰度变化的组织。
• 连接组蛋白丰度变化：H1 变体 H1.0 在适宜温度下，经 T₃处理后，在血液、肝脏和尾鳍中的丰度均增加；而 H1.3 在血液和肝脏中，经 T₃处理后，在特定温度条件下丰度降低，这表明连接组蛋白的丰度变化与温度和 TH 处理密切相关。
• 核心组蛋白丰度变化：核心组蛋白蛋白的丰度变化仅在适宜温度下的肝脏中被观察到，H2B 1 型增加，H3.2、H3.3 和 macroH2A.1 减少，而在其他组织或温度条件下没有显著变化，说明早期 TH 信号在非适宜温度下，对血液、肝脏和尾鳍中组蛋白或染色质相关蛋白的丰度没有全局性影响。
• 非组蛋白染色质相关蛋白丰度变化：MeCP2 在血液和尾鳍中的丰度变化不同，在血液中，适宜温度和转变温度下丰度降低，在尾鳍中适宜温度下丰度增加；HMG 蛋白在肝脏中的丰度变化与温度相关，如 HMGB2 和 HMGB3 在非适宜温度下减少，HMGN3 在适宜温度下增加，体现了这些蛋白丰度变化的组织特异性。
• 组织和温度特异性的 PTM 丰度变化：研究发现，组蛋白和 HMG 蛋白的 PTM 存在温度特异性变化，且不同组织之间的 PTM 变化没有共性。例如，在肝脏和尾鳍中，不同温度条件下的 PTM 变化不同，这突出了 TH 作用的组织特异性以及了解这些变化所处基因组背景的重要性。
• H1 PTM 变化：在适宜温度下，肝脏中 H1.3K108me2 经 T₃处理后增加，但其功能还需进一步研究。
• H3 PTM 变化：H3.2 的 PTM 在肝脏和尾鳍中变化不同，在肝脏中，适宜温度下一些与转录抑制和激活相关的 PTM 如 H3.2K27me2、H3.2K27me3 和 H3.2K36me3 减少，在尾鳍中 H3.2K36me2 增加；同时，H3.2 的乙酰化在不同组织和温度下也有不同变化，这些变化可能与 TH 介导的转录调控有关。
• H4 PTM 变化：H4 的 PTM 在不同组织中也有不同变化，如 H4K12ac、H4K16ac 和 H4K20me2 等，这些变化表明 H4 的甲基化在不同组织和温度条件下存在特异性调控。
• HMG 蛋白 PTM 变化：HMGB2 的甲基化在血液、肝脏和尾鳍中表现不同，在血液和肝脏的非适宜温度下有变化，而在尾鳍的适宜温度下有变化，且这些甲基化位点在人类中尚未有报道，可能揭示 HMGB2 在 TH 信号传导中的新功能。

综合上述研究结果，研究人员首次对温度调节 T₃诱导的两栖动物变态过程中，组蛋白和非组蛋白染色质结合蛋白的全局变化进行了非靶向性研究。发现了多种组蛋白 PTM 和变体在组织和温度上存在特异性变化，这些变化可能参与早期 TH 信号传导和分子记忆的建立。该研究拓宽了人们对变态过程中早期 TH 信号传导阶段潜在表观遗传变化的理解，为后续进一步研究 TH 驱动的表观遗传变化提供了重要依据，也为深入探究两栖动物变态发育的分子机制奠定了坚实基础。