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为探究牡蛎免疫机制，研究人员开展对牡蛎（Magallana gigas）中含 SH3b 结构域的肽聚糖识别蛋白（PGRP）的研究。鉴定出 9 个 MgPGRP 基因，克隆了 MgPGRP5，发现其在多种组织表达，受 PGN 和 LPS 刺激上调，且对多种微生物有结合和凝集活性，有助于理解牡蛎免疫。
在奇妙的生物世界里，免疫系统就像是生物体内的忠诚卫士，时刻守护着机体的健康。其中，肽聚糖识别蛋白（Peptidoglycan Recognition Protein，PGRP）作为一类重要的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRR），在生物的先天免疫反应中扮演着关键角色。它能够识别并结合各种细菌以及病原体相关分子模式（Pathogen - Associated Molecular Patterns，PAMP），进而激活下游的免疫反应。
从进化的长河来看，PGRP 基因广泛存在于从无脊椎动物到脊椎动物的各类生物中。在模式生物，如果蝇（Drosophila melanogaster）中，PGRP 的研究已经取得了显著进展，科学家们对其功能和作用机制有了较为深入的了解。然而，在海洋无脊椎动物，尤其是贝类这一领域，PGRP 的研究却如同刚刚起航的船只，才刚刚开始。
牡蛎（Magallana gigas）作为一种重要的海洋双壳贝类，是研究贝类免疫反应的理想模型。它们生活在复杂的海洋环境中，时刻面临着各种病原体的威胁，却能在这样的环境中生存繁衍，其免疫系统必定有着独特之处。但目前，人们对于牡蛎等海洋贝类中 PGRP 的了解还十分有限，对它们的分子机制、功能多样性以及在免疫调节中的潜在作用都知之甚少。为了填补这些知识空白，深入了解牡蛎的免疫机制，来自大连海洋大学的研究人员开展了一项重要的研究。
研究人员通过一系列实验，得出了许多重要结论。在牡蛎的基因组中，他们成功鉴定出 9 个 MgPGRP 基因，并克隆了其中的 MgPGRP5 基因。MgPGRP5 由一个 SH3b 结构域和一个 PGRP 结构域组成，这一独特的结构预示着它可能具有特殊的功能。进一步研究发现，MgPGRP5 的 mRNA 转录本在牡蛎的血细胞和所有检测的组织中都有表达，其中在肝胰腺中的表达水平最高。当牡蛎受到肽聚糖（Peptidoglycan，PGN）和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激时，血细胞中 MgPGRP5 的 mRNA 表达水平会显著上调。
研究还确定了 MgPGRP5 中两个潜在的结合位点，即 Asp230 和 Glu106，它们对 PGN 和 LPS 的结合起着关键作用。在蛋白定位方面，MgPGRP5 主要位于血细胞的细胞核中，并且在肝胰腺中广泛表达。重组的 MgPGRP5 蛋白（rMgPGRP5）展现出了强大的结合和凝集活性，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及真菌都有作用。这些结果表明，MgPGRP5 是一种新型的模式识别受体，在牡蛎的先天免疫反应中发挥着重要作用。
这项研究成果发表在《Comparative Immunology Reports》上，对于深入理解牡蛎等贝类的免疫机制具有重要意义。它为后续研究贝类如何抵御病原体入侵、维持自身健康提供了关键线索，也为海洋贝类养殖业的病害防治提供了理论依据。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，通过全基因组鉴定和系统发育分析，从牡蛎基因组中筛选出 MgPGRP 基因；其次，利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）技术，检测 MgPGRP5 在不同组织以及受到刺激后的表达变化；然后，借助分子对接技术，确定 MgPGRP5 与 PGN 和 LPS 的潜在结合位点；此外，运用免疫荧光和免疫组化技术，对 MgPGRP5 进行组织定位和亚细胞定位分析；最后，通过微生物结合和凝集实验，探究 rMgPGRP5 对不同微生物的结合和凝集活性。
基因组范围内对牡蛎 PGRP 基因的鉴定
研究人员从 NCBI 数据库下载牡蛎基因组、蛋白质序列及注释信息，利用 HMMER 3.0 软件结合 PF01510 隐马尔可夫模型筛选候选蛋白，再经 NCBI - CDD 和 InterPro 验证，最终确定 9 个推定的 PGRP 蛋白。构建的系统发育树展示了不同 MgPGRP 蛋白的聚类关系，还检测到 5 个保守基序，且发现 MgPGRP3 和 MgPGRP5 含有 SH3b 结构域，PGRP 基因外显子数量在 3 - 10 个之间。
MgPGRP5 mRNA 的表达模式
通过 SYBR Green qRT - PCR 检测发现，MgPGRP5 的 mRNA 转录本在牡蛎的血细胞、肝胰腺、闭壳肌、鳃、性腺和外套膜等组织中均有表达，其中在肝胰腺和血细胞中的表达量最高。受到 PGN 刺激后，血细胞中 MgPGRP5 的 mRNA 转录本显著增加，在 9h 和 12h 分别达到峰值；受到 LPS 刺激后，在 3h、6h、9h、12h、24h 和 48h 时表达水平均显著上调。
MgPGRP5 与 LPS 和 PGN 的分子对接
通过分子对接实验发现，在 MgPGRP5 结构的凹面上存在潜在的配体结合口袋，PGN 和 LPS 可与之相互作用。PGN 的碳水化合物部分与 Leu44、His73、Asn223、Ser227 和 Asp230 等残基形成广泛氢键；LPS 的碳水化合物部分与 Leu44、His73、Glu106、Asn223 和 Ser227 等残基形成广泛氢键。
MgPGRP5 的重组蛋白和多克隆抗体
成功表达并纯化了 rMgPGRP5，SDS - PAGE 检测显示其条带约为 35kDa，与预期相符。用纯化的 rMgPGRP5 制备多克隆抗体，Western blotting 检测表明该抗体特异性良好，能检测到约 30kDa 的单一反应条带，而小鼠预免疫血清组无可见反应条带。
MgPGRP5 蛋白的组织分布和亚细胞定位
免疫组化实验显示，在牡蛎的肝胰腺中可观察到明显的 MgPGRP5 绿色荧光信号，其他组织未观察到。免疫荧光实验表明，在牡蛎血细胞中，MgPGRP5 的阳性信号主要位于细胞核，细胞质中也有少量信号。
rMgPGRP5 的微生物结合和聚集活性
Western blotting 分析表明，rMgPGRP5 对革兰氏阴性菌（大肠杆菌和灿烂弧菌）、革兰氏阳性菌（藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌）以及真菌（毕赤酵母）均有结合活性。与 DAPI 标记的微生物孵育实验显示，rMgPGRP5 对这些微生物具有聚集活性，而对照组 rTrx 则无此现象。
研究结论表明，MgPGRP5 在牡蛎的先天免疫反应中起着重要作用。其在血细胞和肝胰腺中的高表达，以及受到 PGN 和 LPS 刺激后的显著上调，表明它参与了牡蛎对病原体的免疫防御。同时，rMgPGRP5 对多种微生物的广泛结合和凝集活性，进一步证实了它作为模式识别受体的功能。然而，MgPGRP5 结合和凝集不同细菌的详细机制仍有待进一步深入研究。这项研究不仅丰富了人们对牡蛎免疫机制的认识，也为海洋贝类免疫研究领域开辟了新的方向，为后续相关研究奠定了坚实基础，有助于推动海洋贝类养殖业的健康发展。
