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鱼类免疫研究至关重要，为探究干扰素调节因子 9（IRF9）在 Labeo rohita（印度鲮）免疫中的作用，研究人员克隆、鉴定并建模 LrIRF9，发现其在多组织表达，受刺激和感染时表达改变。这为鱼类免疫研究和疾病防控提供关键依据。
在鱼类的世界里，免疫防御如同一场没有硝烟的战争，时刻影响着它们的生存与健康。干扰素调节因子（IRFs）作为这场战争中的重要指挥官，与干扰素（IFNs）协同作战，通过调节干扰素刺激基因（ISGs）的转录，建立起强大的抗病毒防线。然而，尽管在高等脊椎动物中，IFN 信号通路以及 IRFs 的调节作用已被广泛研究，但在鱼类免疫领域，这方面的认知仍如同蒙着一层神秘的面纱，存在诸多未知。
在众多 IRFs 成员中，IRF9 扮演着独特且关键的角色，它是干扰素刺激基因因子 3（ISGF3）的重要组成部分，在抗病毒反应中起着不可或缺的作用。当病原体入侵时，模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs），激活一系列信号级联反应，促使 IRF1、IRF3 和 IRF7 等参与其中，进而增加 I 型干扰素的产生。I 型干扰素与细胞膜上的受体结合，激活 Janus 激酶（JAK） - 信号转导与转录激活因子（STAT）通路，STAT1、STAT2 与 IRF9 相互作用形成 ISGF3 复合物，该复合物进入细胞核，与众多 ISGs 的启动子结合，启动抗病毒基因的表达。
近年来，研究发现 IRF9 在鱼类宿主 - 病原体相互作用中也起着核心作用。例如，在鲫鱼（Carassius auratus）和草鱼（Ctenopharyngodon idella）中，过表达 IRF9 能够显著增强 ISGs 的转录，激活相关免疫反应；而在鲤上皮瘤细胞（EPC）中，敲除 IRF9 则会导致 ISGs 表达下降，病毒复制增强。这些研究表明，深入了解 IRF9 的功能，对于开发水产养殖中的疾病管理策略具有重要意义。
为了揭开鱼类 IRF9 的神秘面纱，来自国内的研究人员（ICAR - CIFA，中央淡水水产研究所）针对印度鲮（Labeo rohita）的 IRF9（LrIRF9）展开了一系列深入研究。他们的研究成果发表在《Comparative Immunology Reports》上，为鱼类免疫领域的发展提供了重要的理论依据和实践指导。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先是分子克隆技术，从印度鲮肾脏组织的转录组序列设计引物，成功克隆出 LrIRF9 的完整开放阅读框（ORF）。接着运用生物信息学分析方法，借助多种在线工具预测 ORF 区域、分析分子质量、等电点、核定位序列（NLS）以及鉴定各种结构域和保守序列等。此外，定量实时 PCR（qRT - PCR）技术被用于检测 LrIRF9 基因在不同组织、细胞以及不同刺激和感染条件下的表达水平变化。
1. LrIRF9 的结构与进化关系
通过克隆得到的 LrIRF9 cDNA 序列包含 1755 个核苷酸，ORF 为 1293 个核苷酸，编码 430 个氨基酸，预测其蛋白质质量约为 48.6 kDa，等电点为 6.36。LrIRF9 蛋白含有两个主要结构域：位于 5 - 117 氨基酸的 DNA 结合域（DBD）和位于 215 - 400 氨基酸的 IRF3 反式激活域。通过结构预测和验证，确定了 DBD 中核苷酸结合残基（如 H44、R83、R85、C86、N89）和 IRF3 反式激活域中肽结合残基（如 Y243、K288、L289、L290、M293、K294、Q313、G314、F317、K330）。系统发育分析显示，LrIRF9 与鲤鱼（Cyprinus carpio）等鱼类的 IRF9 相似性较高，进化关系密切。
2. LrIRF9 基因的基础表达
研究发现，在健康印度鲮幼鱼中，LrIRF9 基因在所有检测的组织（血液、皮肤、肌肉、鳃、脾脏、心脏、肝脏、肠道、肾脏、眼睛和大脑）中均有表达。其中，在肠道中的表达量最高，约为大脑的 207 倍，其次是皮肤、血液等组织，在大脑中的表达量最低。
3. 体内 LrIRF9 基因表达的调节
用聚肌胞苷酸（poly I:C）和脂多糖（LPS）刺激印度鲮幼鱼后，LrIRF9 基因在大多数检测组织中的表达显著增强。在 poly I:C 刺激下，血液、肾脏、肝脏和鳃等组织中的 LrIRF9 基因表达在 6 小时或 12 小时呈现不同程度的升高；LPS 刺激时，除鳃组织外，其他组织中的 LrIRF9 基因表达也明显增加，且在肝脏中 6 小时的诱导倍数高达 37 倍。
4. 体外细胞中 LrIRF9 基因的表达
对红细胞（RBCs）、外周血白细胞（PBLs）和肾脏巨噬细胞（Mφ）进行体外刺激实验，发现 poly I:C 和 LPS 均能显著提高 LrIRF9 基因在这些细胞中的表达。在 RBCs 中，3 小时时 poly I:C 刺激下 LrIRF9 基因表达诱导最为显著；PBLs 在 1 小时时对 poly I:C 刺激反应强烈；Mφ 则在 3 小时时受 poly I:C 刺激后 LrIRF9 基因表达明显增加。LPS 刺激时，RBCs 在 3 小时、PBLs 和 Mφ 在不同时间点的 LrIRF9 基因表达也有所增强。
5. 细菌感染时 LrIRF9 基因的表达
感染嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）后，LrIRF9 基因在不同组织和细胞中的表达呈现差异。感染嗜水气单胞菌后，血液在 24 小时、鳃在 6 小时时 LrIRF9 基因表达显著升高，PBLs 和 RBCs 在 6 小时时表达也明显增加，但肾脏和肝脏中的表达下调。感染迟缓爱德华氏菌后，多数组织和 PBLs 中 LrIRF9 基因表达较低，然而 RBCs 在 6 小时时却出现高表达。在体外感染实验中，印度鲮鳃（LRG）细胞感染嗜水气单胞菌后 1 小时 LrIRF9 基因表达显著升高，随后下降；感染迟缓爱德华氏菌后，LrIRF9 基因表达下调。
研究表明，LrIRF9 在印度鲮的免疫反应中发挥着重要作用。其结构中的关键氨基酸残基可能参与特定的相互作用，影响其功能。LrIRF9 基因在多种组织和细胞中的广泛表达，以及对 PAMPs 刺激和病原体感染的动态响应，显示出它在鱼类免疫防御中的重要地位。
此外，该研究还为后续研究提供了诸多有价值的方向。一方面，通过生物信息学分析确定的关键氨基酸残基，为进一步探究 IRF9 的信号传导机制奠定了基础，有助于明确哪些氨基酸启动了免疫信号级联反应。另一方面，对免疫细胞（如 PBLs、Mφ 和 RBCs）中 LrIRF9 基因表达的研究，为鱼类免疫细胞的研究和疫苗开发提供了新的思路。例如，优化免疫细胞的分离方法，可应用于其他鱼类，实现对鱼类免疫参数的长期监测，有助于早期疾病诊断、疫苗疗效评估以及鱼类健康管理等。同时，研究鱼类红细胞中 IRF9 的表达和相关通路，对于理解红细胞在应对细菌和病毒感染时的免疫作用具有重要意义。
综上所述，这项研究深入揭示了印度鲮 IRF9 的结构和功能，为鱼类免疫领域的研究开辟了新的道路，有望推动水产养殖疾病防控策略的进一步发展。
