基于AlphaFold与加速分子动力学模拟的真菌疏水蛋白I/II类结构解析及构象动态研究

本研究针对真菌疏水蛋白(HFB)结构数据匮乏的问题，采用AlphaFold2(AF2)预测结合500 ns加速分子动力学(aMD)模拟技术，成功解析SC3、HFB9A等4种I/II类HFB的折叠构象与动态特征。发现I类HFB9A具有独特的高无序性，而II类HFB呈现更稳定的β-桶状核心结构，为理解HFB界面自组装机制及生物医学应用提供理论依据。

　　

在真菌王国中，疏水蛋白(HFB)是一类具有"生物表面活性剂"特性的神奇分子。这些7-15 kDa的小蛋白能自发在气液界面形成两亲性单层膜，帮助真菌形成疏水性孢子、菌丝等结构，在自然界中扮演着"分子建筑师"的角色。尽管HFB在生物传感器涂层、药物递送系统和医疗植入物等领域展现出巨大应用潜力，但科学界对其精确三维结构的认知仍存在显著空白——蛋白质数据库(PDB)中仅有少数HFB结构被解析，且传统同源建模方法往往只能预测具有序列相似性的区域。

面对这一挑战，匈牙利的研究团队将目光投向了人工智能辅助的结构预测技术。他们选取了具有代表性的4种HFB蛋白：来自Schizophyllum commune的SC3和Trichoderma harzianum的HFB9A作为I类代表，Trichoderma asperellum的HFB2-6与特殊亚型的HFB7作为II类代表。这些蛋白的选择颇具战略眼光——SC3是研究最深入的I类HFB"标杆"，HFB9A则是结构未知的"神秘分子"；而II类中的HFB7仅在特定Trichoderma分支表达，具有独特的生物学特性。这项创新性研究发表在《Computational and Structural Biotechnology Journal》上，为理解HFB的结构-功能关系开辟了新途径。

研究团队采用了两大核心技术：首先利用AlphaFold2(AF2)获得初始结构预测，随后通过加速分子动力学(aMD)模拟进行构象优化。aMD技术通过施加偏置势能帮助系统跨越能垒，在500 ns内实现了传统MD需要微秒级时间才能完成的构象采样。特别值得注意的是，团队采用了双boost策略——同时提升扭转角和总势能项，并运用Maclaurin级数展开进行重加权处理，有效降低了统计噪声。

在结构预测方面，AF2成功预测了SC3特征性的β-桶状核心和两个α螺旋，但对其19-58位残基的无序环区预测置信度(plDDT)较低。而HFB9A的整体预测结果更不理想，呈现明显解折叠状态。相比之下，II类HFB2-6和HFB7的核心结构预测较为完整，但N端区域同样显示低置信度。

通过aMD模拟获得的动态结构特征揭示了重要发现：
• 构象稳定性分析显示，I类HFB的N端区域波动显著，SC3表现出典型的两个无序环(20-50和100-120位残基)，而HFB9A虽属I类却缺乏这种特征。II类HFB则整体更加稳定，HFB7的RMSF值最低。
• 二级结构演化轨迹表明，SC3的β-桶和α螺旋在模拟中保持稳定，而HFB9A仅形成部分β-折叠。II类HFB的构象保守性显著高于I类，这与它们较短的环区长度和更高的序列相似性相符。
• 疏水性分析发现，SC3的平均疏水值(0.586)显著高于HFB9A(0.412)，且高波动区域对应亲水性残基。这解释了HFB9A在植物根部内殖过程中的特殊功能——其相对亲水性可能有利于与植物内部环境相互作用。

通过二面角主成分分析(dPCA)构建的自由能景观(FEL)进一步揭示了构象差异：
• SC3形成12个聚类，代表构象主要差异在环区而非核心结构。HFB9A的9个聚类均未形成完整β-桶，呈现高度动态性。
• II类HFB中，HFB2-6形成半开放β-桶结构，与Neurospora crassa的NC2相似；HFB7则表现出更完整的β-桶折叠，其构象在模拟早期即趋于稳定。

研究团队还深入分析了HFB的内在无序性(intrinsic disorder)：
• IUPred3预测显示HFB9A全序列高度无序，SC3则在两个特征环区呈现无序性，而II类HFB整体更为有序。
• 天然接触分数(Qs)和回转半径(RoG)分析证实，HFB9A在模拟中保持最松散构象，而II类HFB紧凑性最佳。
• Lipari-Szabo序参数(S²)计算发现，SC3两个无序环区的N-H键波动剧烈(S²≈0)，与实验观察到的EAS蛋白行为一致。

这项研究的重要意义在于：首次系统比较了I/II类HFB的构象动态差异，揭示了HFB9A作为I类成员却缺乏典型结构特征的独特性质。通过结合AF2与aMD技术，突破了传统方法对无序蛋白研究的局限，为HFB在生物材料领域的应用提供了关键结构依据。特别是发现II类HFB因结构稳定更适于需要刚性界面的应用，而I类HFB的动态性可能有利于需要构象变化的界面自组装过程。这些发现不仅深化了对HFB构效关系的理解，也为理性设计基于HFB的功能材料奠定了理论基础。