MORF1通过调控orf224转录本编辑影响甘蓝型油菜polima细胞质雄性不育系统的育性机制

本研究针对甘蓝型油菜polima细胞质雄性不育（pol CMS）系统中育性调控机制不明确的问题，通过酵母双杂交和CRISPR/Cas9技术，揭示了线粒体RNA编辑因子Bna.MORF1与育性恢复蛋白RFP的互作关系，证实orf224基因的过表达导致不育表型，并发现花药特异性脯氨酸富集蛋白（APG）参与育性调控。该研究为pol CMS系统在油菜育种中的应用提供了分子机制支撑。

　　

在农作物杂交育种领域，细胞质雄性不育（CMS）系统犹如一把"生殖锁"，能有效控制花粉发育以实现杂交种子的规模化生产。甘蓝型油菜的polima（pol）CMS系统因其育性稳定、配合力高，已成为我国杂交油菜育种的主力军——全国70%的油菜杂交种通过该系统生产。然而这把"锁"的分子钥匙始终成谜：虽然已知育性恢复基因Rfp（编码P型PPR蛋白）能抑制线粒体不育基因orf224/atp6的表达，但二者如何"隔空对话"的调控通路仍是一片空白。

华中农业大学的研究团队通过多学科技术联用，首次发现线粒体RNA编辑因子Bna.MORF1在pol CMS系统中扮演着"分子信使"的关键角色。研究采用酵母双杂交筛库技术，从近等基因系cDNA文库中捕获到Bna.MORF1与RFP蛋白的直接互作；通过CRISPR/Cas9敲除实验证实，Bna.MORF1功能缺失会导致油菜完全不育，表现为花药萎缩、花瓣皱缩等典型pol CMS表型。更关键的是，circular RT-PCR技术揭示Bna.MORF1通过调控orf224/atp6转录本的可变剪切实现育性恢复——在恢复系中，1,874 nt的全长转录本被截短为1,520 nt的功能缺陷型变体。

研究团队还构建了orf224过表达系统，通过在拟南芥和油菜中异源表达该基因，成功重现了不育表型，验证了其作为pol CMS核心效应分子的地位。RNA-EMSA实验显示，RFP并不直接结合orf224 mRNA，而是通过Bna.MORF1介导形成三元复合物。更有趣的是，酵母筛库发现花药特异性脯氨酸富集蛋白（APG）能与orf224蛋白直接互作，CRISPR敲除Bna.APG同样导致花药发育异常。这些发现拼凑出了pol CMS的完整调控拼图：RFP-MORF1蛋白复合物通过重塑orf224转录本，解除其对APG蛋白的干扰，从而恢复花药正常发育。

关键技术方法包括：酵母双杂交筛选互作蛋白、CRISPR/Cas9基因编辑、circular RT-PCR分析转录本变异、RNA-EMSA验证核酸-蛋白互作、亚细胞定位（线粒体标记示踪）以及拟南芥/油菜遗传转化体系。实验材料采用pol CMS系6330A、保持系6330B和恢复系Bing 409。

3.1节通过酵母双杂交和荧光互补实验，证实Bna.MORF1与RFP存在物理互作，免疫共沉淀进一步验证该互作在油菜体内真实存在。亚细胞定位显示Bna.MORF1定位于线粒体，与其RNA编辑功能相符。

3.2节利用CRISPR/Cas9构建Bna.MORF1敲除株系，T₁代呈现典型不育表型，qRT-PCR显示同源基因BnaA03g44360D表达显著下调。转录组分析发现恢复系中orf224/atp6出现特异性剪切变异体。

3.3节通过RNA-EMSA证明Bna.MORF1能直接结合orf224 mRNA特定区域（探针3），而RFP仅通过蛋白互作间接调控。

3.4节在拟南芥和油菜中过表达orf224均导致花粉败育，表型与自然pol CMS完全一致，确证其不育基因身份。

3.5-3.6节揭示APG作为orf224的下游效应因子，二者互作干扰花药发育。CRISPR敲除Bna.APG（BnaA03g42520D）同样引发不育，其线粒体定位暗示与能量代谢的潜在关联。

讨论部分强调，该研究首次构建了pol CMS的"三位一体"调控模型：RFP作为PPR蛋白支架，招募Bna.MORF1形成编辑复合体，通过改变orf224转录本结构解除其对APG的抑制作用。这一发现不仅解释了pol CMS育性转换的分子开关，更为作物CMS系统的设计育种提供了新靶点——通过调控MORF1介导的线粒体RNA编辑通路，有望实现不育系的人工定制。研究还拓展了对核-质互作认知：线粒体基因可通过RNA编辑层面与核基因"对话"，而花药发育关键蛋白APG可能是多