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为提升 β- 紫罗兰酮产量，研究人员对烟草（Nicotiana tabacum）中 CCD4 开展研究。他们鉴定出 NtCCD4a 和 NtCCD4b，发现 NtCCD4a 能催化生成 β- 紫罗兰酮。优化其活性后，突变体 F181G、F184L、F337M 可提高产量，为作物 CCD4 工程设计提供框架。
在植物的奇妙世界里，类胡萝卜素就像一群神奇的 “小精灵”，它们不仅在光合作用和光保护中发挥着关键作用，还是人类维生素 A 的重要前体。而从类胡萝卜素衍生出来的 β- 紫罗兰酮，更是在医疗保健和制药领域有着巨大的潜力，可用于制造各种药物和保健品，就像一把能打开健康大门的神奇钥匙。
然而，目前在 β- 紫罗兰酮的生产过程中却遇到了重重困难。类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）作为 β- 紫罗兰酮生物合成中的关键酶，其活性较低，尤其是 CCD4 在催化 β- 胡萝卜素生成 β- 紫罗兰酮时效率不高，这就像是在生产线上设置了一道 “减速带”，严重阻碍了 β- 紫罗兰酮的大量生产。同时，之前对植物来源的 CCD1 进行蛋白质工程改造，以生产 β- 紫罗兰酮的进展也十分有限。所以，如何提高 CCD4 的活性，从而提升 β- 紫罗兰酮的产量，成为了科研人员亟待解决的问题。
为了攻克这些难题，河南工业大学的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们以烟草（Nicotiana tabacum）为研究对象，聚焦于烟草中的类胡萝卜素裂解双加氧酶 4（CCD4），致力于通过优化 CCD4 的活性来增加 β- 紫罗兰酮的产量。经过一系列艰苦的实验和研究，他们成功鉴定出烟草中 CCD4 的两种亚型 NtCCD4a 和 NtCCD4b，并发现 NtCCD4a 的表达水平明显高于 NtCCD4b，且能有效催化 β- 胡萝卜素生成 β- 紫罗兰酮。在此基础上，研究人员运用基于结构的理性设计方法，对 NtCCD4a 的活性口袋进行改造，通过高通量筛选突变体，最终获得了 F181G、F184L 和 F337M 这三个单碱基突变体，这些突变体相较于野生型，能够显著提高 β- 紫罗兰酮的产量。并且，转这些突变体基因的烟草植株，β- 胡萝卜素的裂解加速，β- 紫罗兰酮产量也大幅增加。这一研究成果意义重大，不仅为通过基因组编辑技术设计主要作物中的 CCD4 奠定了基础，还为其他代谢途径关键基因的结构引导理性设计提供了新的思路和方法。该研究成果发表在《The Crop Journal》上。
研究人员在这项研究中用到了多个关键技术方法。首先是生物信息学分析，通过筛选烟草基因组数据库获取 NtCCD4 的序列信息；其次利用固相微萃取气相色谱 - 质谱联用（SPME-GC-MS）技术，检测 β- 紫罗兰酮的生成；还运用蛋白质模型构建和分子对接技术，分析蛋白与底物的相互作用；通过定点饱和突变（SM）构建突变体库筛选高活性突变体。
3.1 NtCCD4a 是叶绿体中的主要转录本
研究人员通过系统的分析方法，包括系统发育分析、序列比对、保守结构域和外显子 - 内含子结构研究以及 qPCR 检测等，发现 NtCCD4a 和 NtCCD4b 同属 CCD4 亚家族，二者编码的蛋白质大小相同，且具有相似的保守结构域。不过，NtCCD4a 在烟草幼苗的叶、茎、根以及成熟叶中的表达水平均高于 NtCCD4b。同时，通过将 NtCCD4a 和 NtCCD4b 的开放阅读框（ORF）与 GFP 融合并在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达，利用激光扫描共聚焦显微镜观察发现，它们均积累在成熟烟草叶片的叶绿体中。由此得出结论，NtCCD4a 是叶绿体中的主要转录本。
3.2 NtCCD4a 催化 β- 胡萝卜素生成 β- 紫罗兰酮
为研究 NtCCD4a 的酶活性，研究人员构建了 pMAL-c5x-NtCCD4a 质粒，并将其与含有 β- 胡萝卜素合成相关基因簇的 pAC-β 质粒共转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中。通过观察菌落颜色变化、测定 440nm 处吸光度以及运用 SPME-GC-MS 分析，发现含有 NtCCD4a 的大肠杆菌 β- 胡萝卜素含量降低，且能产生 β- 紫罗兰酮。此外，细菌色素互补试验表明 NtCCD4a 和 NtCCD4b 在催化 β- 胡萝卜素裂解方面具有相似活性，综合这些结果，确定 NtCCD4a 可催化 β- 胡萝卜素生成 β- 紫罗兰酮，因此选择 NtCCD4a 作为后续深入研究的目标基因。
3.3 半理性设计 NtCCD4a 以提高 β- 紫罗兰酮产量
研究人员对 NtCCD4a 进行蛋白质 - 配体相互作用指纹分析，确定了与 β- 胡萝卜素接触的 21 个残基，排除 6 个高度保守残基后，对其余 15 个残基构建突变体库进行定点 SM 筛选。结果发现，突变体 F181G、F184L 和 F337M 裂解 β- 胡萝卜素的能力更强。进一步对这些点突变进行组合，生成一个三突变体和三个双突变体，经筛选发现，F337M 在所有单突变和组合突变中，对 β- 胡萝卜素的转化率最高。
3.4 NtCCD4a 突变体的结构模型和催化性能分析
通过比较野生型和突变体的蛋白质结构，研究人员发现 β- 胡萝卜素是一种高度疏水且非极性的线性分子，野生型 NtCCD4a 中 3 个苯丙氨酸残基（181、184 和 337）位于催化口袋入口附近，限制了 β- 胡萝卜素的进出。而突变体 F181G、F184L 和 F337M 中，这些位点被较小的氨基酸取代，使得底物通道显著拓宽，催化口袋体积增大，β- 胡萝卜素更容易进入，从而提高了突变体的催化活性。
3.5 半理性设计的 NtCCD4a 提高了转基因烟草中 β- 紫罗兰酮的生成
研究人员将野生型 NtCCD4a 及其突变体 F181G、F184L 和 F337M 的 ORF 分别插入 pCAMBIA sup1300 载体，转化烟草获得转基因植株。对转基因植株进行表型分析、类胡萝卜素含量测定以及 GC-MS 分析代谢物等研究后发现，虽然突变体转基因植株的株高、叶面积和生物量以及部分类胡萝卜素含量低于野生型 NtCCD4a 转基因植株，但 β- 紫罗兰酮含量显著增加。KEGG 通路分析表明，突变体转基因植株在萜类化合物生物合成途径上显著富集，且 β- 紫罗兰酮与多种代谢物呈正相关。
在研究结论和讨论部分，研究人员成功利用基于结构的理性设计策略，优化了烟草中 NtCCD4a 的活性，筛选出 F181G、F184L 和 F337M 等突变体，有效提高了 β- 紫罗兰酮的产量。这一研究为利用高等植物作为更高效的系统合成 β- 紫罗兰酮提供了新的方法，所建立的方法框架有望用于设计关键酶的催化特性，进而对类胡萝卜素代谢途径进行工程改造。同时，该研究也为高等植物其他代谢途径关键基因的结构引导理性设计提供了重要参考，在生命科学和农业生物技术领域具有重要的理论和实践意义。
