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本文聚焦于无标记光学成像技术，详细介绍了相衬显微镜（PCM）、二次谐波产生（SHG）等多种单模态技术及其应用，阐述了多模态成像的发展与优势，还探讨了面临的挑战与前景，对生物医学研究意义重大。
引言
光学成像凭借实时、高分辨率和无创的特点，在生物医学研究与临床应用中广泛使用。但许多生物样本对比度不足，需依赖外源性标记，这存在干扰生物过程、产生假阳性信号等问题。无标记光学成像技术依赖内源性对比度，能减少光毒性，提升效率，降低对生物过程的干扰。多模态成像整合多种无标记模态，可获取更全面的生物信息，克服单模态的局限。
光学无标记成像模态
- 相衬显微镜：相衬技术能增强透明物体对比度，泽尼克于 20 世纪 30 年代初发现并发明相衬显微镜。定量相成像（QPI）基于相衬原理，可测量相移，实现细胞的 3D 映射，应用于细胞生长速率测量等方面。数字全息显微镜（DHM）由 QPI 发展而来，通过叠加物光和参考光形成全息干涉图，经处理生成实时全息图像，用于监测细胞生物物理特性变化等。数字在线全息显微镜（DIHM）是 DHM 的替代方案，光路更简单，但需要更先进算法，用于无标记细胞类型识别等。
- 二次和三次谐波产生：1961 年弗兰肯等人在石英晶体中观察到二次谐波产生（SHG），1990 年登克等人改进共聚焦显微镜实现双光子激发荧光（2PEF），2003 年考克斯等人将 SHG 应用于 2PEF 成像胶原蛋白结构。SHG 仅能从非中心对称材料产生内源性对比度，常用于生物成像中的胶原蛋白检测，如辅助诊断甲状腺乳头状癌和乳腺癌等。三次谐波产生（THG）原理与 SHG 相似，其对比度源于成像物体折射率的强烈变化，适用于细胞膜和脂质成像，常用于发育生物学和脑组织结构成像。
- 光学相干断层扫描：1991 年詹姆斯?G?藤本团队首次提出光学相干断层扫描（OCT），商业化后在多个生物医学领域用于非侵入性、无标记的细胞和组织形态成像。OCT 通过测量生物样本微结构背向散射近红外光的强度和回波时间延迟生成图像，空间分辨率达微米级，穿透深度数百微米，在眼科、皮肤科等临床领域应用广泛。近年来，其应用范围进一步拓展，但 OCT 主要提供形态结构信息，缺乏亚细胞水平的化学成分和代谢活动信息，与其他模态结合可实现多维分析。
- 自荧光成像：细胞内源性荧光物质如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）可实现无标记、非侵入性体内成像，其氧化还原比（NADH/FAD）反映细胞氧化还原状态。非线性多光子荧光（MPF）成像技术不断发展，降低了光子毒性，提高了时空分辨率。多光子荧光寿命成像显微镜（MPF-FLIM）可实时监测组织发育和支架完整性等，但存在光谱串扰和其他自发荧光成分干扰的问题，不过其无损、快速、高分辨率的特点使其在体内代谢研究中广泛应用。
- 光声断层扫描：光声断层扫描（PAT）是一种混合无标记生物成像方法，利用光声效应，根据样本中有机吸收体局部加热产生的声波进行成像。聚焦光束扫描实现光声显微镜（PAM）的高空间分辨率，宽场照明则用于光声计算机断层扫描（PACT）的全身体积成像。PAT 技术不断进步，用于人体血管高速成像辅助癌症诊断，深度学习提高了 PACT 血流动力学测量信息，紫外线 - 光声显微镜（UV-PAM）有望替代传统染色方法进行组织学诊断。
- 受激拉曼散射：振动光谱技术基于分子键振动模式的独特光谱指纹识别生物分子，受激拉曼散射（SRS）通过调谐两个同步脉冲激光的能量差匹配分子振动能量，实现相干激发，提高了检测效率，成为无标记生物医学成像的重要技术。研究人员通过多种方法提高 SRS 对生化分析物的灵敏度，如预共振激发和受激拉曼 - 光热显微镜技术。此外，还在成像速度、体积成像和空间分辨率方面进行创新，如集成空间光调制器提高成像速度和实现体积成像。
多模态成像
- 近期应用和发展：多模态生物成像近年来发展迅速，通过组合不同模态克服单一模态的局限性，在组织病理学、肿瘤微环境成像和治疗效果评估等方面应用广泛。例如，同时无标记自荧光 - 多谐波（SLAM）显微镜结合多种技术进行三维组织学成像和癌症治疗效果评估；李等人整合多种模态可视化三阴性乳腺癌（TNBC）的代谢和结构特征，利用氘标记追踪代谢过程，该技术在研究与年龄相关疾病的代谢变化方面具有潜力。在临床应用中，多模态成像技术根据不同疾病需求进行整合，如 PET/MRI 用于阿尔茨海默病诊断，多种光谱技术结合用于鼻咽癌诊断，无标记多模态成像在组织水平诊断中展现出优势。
- 多模态生物成像图像处理的发展：随着无标记成像技术产生大量多参数数据，机器学习在数据分析中发挥重要作用。在图像去卷积方面，基于自适应矩估计（Adam）优化的点彩画去卷积（A-PoD）算法等提高了无标记成像技术的分辨率；深度学习在无标记检测和生化识别方面取得进展，如单组分深度学习算法用于光声组织学的虚拟染色和疾病组织分类，改进的光谱匹配协议增强了化学识别能力。
总结和展望
本文综述了无标记成像技术的最新创新成果，这些技术的发展依赖于空间和时间分辨率的突破。多模态成像在生物医学研究和临床诊断中应用广泛，但仍面临成本高、数据对齐困难、对比度有待提高等挑战。未来需要开发标准化的设置和用户友好的工作流程，将自动化融入成像过程，利用人工智能和机器学习改进数据分析技术，推动无标记多模态成像技术的广泛应用。
