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本文聚焦高尔基体物质运输的结构生物学进展。研究揭示了 Arf 和 Rab 鸟苷酸交换因子（GEFs）的独特结构、AP-3 货物适配体的新构象，以及囊泡系链识别靶标的机制，为理解细胞内运输提供了关键见解。
引言
细胞内通过高尔基体复合体的囊泡运输是真核细胞的重要特征。高尔基体平衡顺向和逆向运输途径，在内质网（ER）、质膜和内溶酶体区室之间分选货物并回收运输机制。大多数运输途径由 Arf 和 Rab 家族的 GTP 酶调节，它们是 Ras “小” GTP 酶超家族中最大的两个家族。鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）和 GTP 酶激活蛋白（GAPs）分别催化 GTP 酶的激活和失活，调节运输事件的发生位置和时间。本文将重点介绍近期关于高尔基体运输因子的结构研究新进展。
不同结构揭示 Arf-GEF 调节机制
高尔基体货物分选途径的启动需要激活 Arf 家族 GTP 酶，高尔基体 Arf-GEFs 是 COPI、AP-1、AP-3 和 GGA 途径中囊泡生物发生的重要上游调节因子。早期 / 顺面高尔基体 Arf-GEFs（酵母中的 Gea1 和 Gea2 以及哺乳动物中的 GBF1）和晚期 / 反面高尔基体 Arf-GEFs（酵母中的 Sec7、哺乳动物中的 ARFGEF1/BIG1 和 ARFGEF2/BIG2）在序列和结构域组织上相似，但调节方式差异很大。
近期，全长高尔基体 Arf-GEFs 的结构被首次解析。研究发现，Gea2 和 Sec7 中保守的两亲性螺旋是重要的膜结合元件，这有助于理解这些 GEFs 在高尔基体膜表面的取向。Gea2 和 Sec7 的调节结构域都采用类似的 α - 螺旋结构，但二聚化机制完全不同。Gea2 通过 N 端 DCB/HUS 结构域二聚化，形成跨度 28nm 的二聚体；Sec7 通过 HDS4 结构域二聚化，形成跨度 42nm 的二聚体。
此外，研究还观察到 Gea2 在激活底物 Arf1 过程中，GEF 结构域存在两种不同构象，而 Gea2 - Arf1 激活中间复合物只有一种构象。这表明 Gea2 在激活反应中的构象变化使 Arf1 处于最佳位置，以便 Arf1 的膜结合 α - 螺旋在结合 GTP 后插入膜中。
Sec7 的冷冻电镜结构揭示了其自身抑制的结构基础。GEF 结构域的催化表面与 HDS2 结构域相互作用，使 GEF 结构域位于假定的膜结合表面上方，空间位阻阻碍了底物结合位点。预测的 Sec7 结构表明，它在激活状态下的 Arf1 激活机制可能与 Gea2 相似。
另外，Gea2 与 Arl1 结合的结构也被报道。Arl1 是 Arf 家族 GTP 酶，不是 Gea2 的底物，但可能与 Gea2 共同调节或发挥作用。Gea2 - Arl1 复合物中 Gea2 的结构与之前报道的基本相同，二者相互作用涉及 Gea2 的 DCB 结构域和 Arl1 与效应蛋白 Imh1 及其他 golgin 结合的表面。Arl1 表面的突变会破坏与 Gea2 和 Imh1 的相互作用，影响 Imh1 的定位，还会部分破坏 Arl1 的定位，但具体机制未知，Gea2 - Arl1 相互作用的意义仍有待明确。
高变区的重要性
近期报道了 Rab6、Rab11 和 Rab1 的 Rab - GEF 复合物 Ric1 - Rgp1、TRAPPII 和 TRAPPIII 的结构，揭示了不同的 GEF 结构。这里重点介绍 Ric1 - Rgp1 复合物与底物 Rab6 结合的冷冻电镜结构。
Ric1 - Rgp1 异二聚体呈两叶结构。较大的叶由 Ric1 的两个 β - 螺旋桨结构域和 Rgp1 的抑制蛋白结构域组成；较小的叶由 Ric1 的 C 端螺旋结构域（一种新的 Rab - GEF 结构域）和 Rgp1 的一对螺旋组成。Rgp1 中保守的两亲性螺旋对高尔基体定位很重要，可能通过直接与膜表面相互作用实现。
Ric1 - Rgp1 复合物通过 Ric1 的新 GEF 结构域和 Rgp1 的抑制蛋白结构域分别与 Rab6 的球状结构域和 “高变区”（HVD）相互作用。HVD 是一段短（约 30 个残基）的柔性 C 端区域，通过 C 端的两个异戊二烯化半胱氨酸残基将 GTP 酶的球状结构域连接到膜表面。研究表明，Rab6 HVD 的序列对 Ric1 - Rgp1 在体外激活 Rab6 和 Rab6 在体内的定位很重要，说明 Rgp1 与 Rab6 HVD 的相互作用在功能上至关重要。
TRAPP 复合物也与 Rab 底物的 HVD 相互作用，这种相互作用对 TRAPPII 复合物尤为重要，它利用 HVD 区域识别底物 Rab11 并将 Rab1 排除在活性位点之外。随着对三种不同 Rab - GEFs 与 Rab 底物 HVD 结合的研究，似乎 HVD 结合可能被其他 Rab - GEFs 用于结合底物。
货物适配体的多种构象
运输囊泡中的货物富集需要与货物适配体或货物受体相互作用。AP - 3 货物适配体的新结构为其功能提供了重要见解。
AP - 3 复合物将货物从高尔基体分选到溶酶体。AP - 3 属于一类货物适配体家族，该家族成员具有相似的结构域组织，包含两个大亚基、一个中亚基和一个小亚基。对 AP - 1 和 AP - 2 复合物的广泛结构表征以及对酵母 AP - 3 复合物的结构研究，为理解 AP 复合物功能的结构生物学提供了参考。
尽管已有大量结构研究，但关于适配体蛋白复合物在货物分选和囊泡生物发生过程中如何在细胞器膜上进行结构转变仍存在重要问题。Briggs 实验室的开创性研究阐明了 AP - 2 与网格蛋白外壳在囊泡膜上的组织形式，揭示了 AP - 2 与含货物膜结合时的构象。Baker 实验室近期报道了人 AP - 3 的几种冷冻电镜结构，包括可溶性和脂质纳米盘膜结合结构，涵盖了 AP - 3 与招募的 GTP 酶 Arf1 结合、与溶酶体货物蛋白 Lamp1 的一部分结合以及未结合的可溶性状态。这些结构揭示了货物适配体在被 Arf1 招募到高尔基体并与货物结合过程中可能经历的多种构象变化，提出了一种机制，即适配体聚合需要货物结合和增加的膜曲率，解释了货物分选如何与囊泡外壳组装和膜变形相耦合。
系链如何识别靶标
囊泡在靶标区室的融合由蛋白质系链促进，蛋白质系链确保运输囊泡与正确的膜伙伴对接。已鉴定出两类蛋白质系链：golgin 和多亚基系链复合物（MTCs）。golgin 是通过长卷曲螺旋结构域同源二聚化的蛋白质，通过蛋白质一端与高尔基体（或其他细胞器）结合，另一端与运输囊泡结合来系住膜；MTCs 似乎既起系链作用，又调节膜融合，通过包括 GTP 酶和负责驱动膜融合的 SNARE 蛋白等多个伙伴与细胞器和囊泡膜相互作用。
已确定了几种 golgin 的细胞器特异性机制，通常涉及与 Arf 或 Rab GTP 酶的相互作用，但 golgin 识别特定类型囊泡的机制尚不清楚。Munro 实验室先前发现 TBC1D23 是一种特异性因子，与 golgin - 97 和 golgin - 245 一起特异性捕获内体来源的囊泡。近期，Munro 和 Owen 实验室合作确定了 TBC1D23 识别内体囊泡的机制基础。他们发现 TBC1D23 直接与囊泡内的货物蛋白羧肽酶 D 以及 SNARE 蛋白 syntaxin - 16 相互作用，这两种蛋白都通过一种新的 “酸性 TLY” 基序与 TBC1D23 结合。研究人员确定了该基序与 TBC1D23 结合的晶体结构，并通过设计突变阻止细胞中的囊泡捕获，证实了这种相互作用的重要性。该基序也存在于其他几种货物蛋白中，支持了一种新的范式，即囊泡捕获通过囊泡内运输的多种货物蛋白上的共享基序发生。
除了作为系链的作用，MTCs 还被认为调节膜融合中 SNARE 复合物的功能。一些 MTCs 含有 “SM” 亚基，可促使 SNARE 配对，但其他 MTCs 则没有。与 SNARE 蛋白的 SM 非依赖相互作用也很重要，但这种功能的机制基础尚不清楚。Hughson 实验室近期报道了 Dsl1 复合物的冷冻电镜结构，Dsl1 复合物是一种内质网定位的 MTC，不含 SM 蛋白，它与内质网定位的 SNARE 蛋白的可溶性部分结合。Dsl1 复合物对高尔基体来源的 COPI 囊泡与内质网的融合至关重要。该结构揭示了新的 MTC - SNARE 相互作用，使 Dsl1 复合物稳定在伸长的金字塔形构象中，类似于在质膜发挥作用的 MTC—— 外泌体的结构。研究人员发现破坏 Dsl1 复合物中 SNARE 相互作用界面的突变是致死的，验证了这些相互作用的重要性，解释了该复合物如何确保只有正确的囊泡才能与内质网融合。
结论
本文重点介绍了高尔基体运输结构生物学的几项最新进展。对高尔基体 Arf - 和 Rab - GEFs 的结构分析表明，每种 GEF 都有独特的结构，与其不同的调节行为一致；对 AP - 3 货物适配体的深入结构分析揭示了其他货物适配体未曾观察到的新构象；不同的系链复合物也进化出了不同的结构和结构状态。这些研究揭示的原理对高尔基体以外的其他细胞器和途径的运输具有广泛的相关性。
尽管取得了这些进展，但关于本文重点介绍的蛋白质和其他运输因子如何执行其关键功能仍有许多未知。运输结构生物学的下一个前沿将涉及膜结合结构。许多运输机制在细胞器和囊泡膜的细胞质表面发挥作用，因此需要更多类似于 Baker 和 Briggs 实验室的研究，利用冷冻电镜研究膜结合蛋白。
已知多种因素影响高尔基体 Arf - 和 Rab - GEFs 的定位，包括膜表面电荷和效应蛋白，但大多数通过一个或多个两亲性螺旋直接与膜表面结合。已确定 Gea2、Sec7、TRAPPIII 和 Ric1 - Rgp1 中保守的两亲性螺旋是重要的高尔基体膜结合元件，但这些螺旋在实验冷冻电镜密度图中均无法解析，这表明它们与蛋白质其余部分的连接较为灵活。未来需要对膜结合结构进行研究，以精确阐明这些蛋白质如何与脂质膜相互作用，以及它们的构象是否受膜结合的影响。
同样，为了全面阐明 Dsl1 复合物和其他 MTC 复合物调节囊泡系链和融合的机制，需要对它们与膜结合时的结构进行表征。
