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本文聚焦神经肽信号网络，阐述其在神经系统功能中的重要作用。通过绘制网络揭示其保守组织特征，介绍体内（in vivo）传感器技术突破，探讨网络结构变化，为理解神经肽调节机制提供思路，助力神经系统功能研究。
引言
神经系统功能依赖神经元间的突触（有线连接）和 “无线” 的突触外信号传递两种主要通信模式。目前，突触连接组的结构已通过连接组学领域的大量工作得以全面绘制，但像单胺和神经肽这类可扩散信号分子构成的无线信号网络的组织方式，一直是研究难题，尤其是神经肽。
神经肽是神经信使中数量最多、种类最丰富的一类，主要与 G 蛋白偶联受体（GPCRs）结合，广泛存在于动物神经系统中，几乎参与所有大脑功能，如调节代谢、发育、生殖以及行为、学习和动机状态等生物过程。然而，由于绘制神经元间神经肽传递存在技术挑战，人们对神经肽通路网络的组织和相互作用了解甚少。不过，随着技术进步，绘制神经肽相互作用和可视化体内神经肽活动成为可能，使人们对这些网络的机制理解有了实验基础。
绘制神经肽信号网络 —— 保守的组织原则
自 20 世纪 70 年代发现首个脑阿片受体以来，众多肽激活受体被发现参与调节大脑功能。动物基因组通常编码约 100 - 150 种不同的肽 GPCRs，编码肽的基因也具有相似的多样性。近年来，单细胞 RNA 测序和系统荧光报告研究极大地拓展了人们对神经肽和 GPCR 表达的理解，能够在动物大脑中进行细胞分辨率的基因表达图谱绘制。研究发现，神经肽和受体基因在神经系统中普遍表达，大多数神经元会表达多种神经肽和肽激活的 GPCRs，且组合方式往往因神经元细胞类型而异。这种复杂的组合表达模式在不同动物门类中都存在，表明肽网络中的状态和信息流是由多种神经肽的协同作用决定的。
通过整合单神经元转录组数据和肽 - 受体相互作用知识，可以预测神经元间的神经肽信号传递路径，绘制出神经肽连接组。该连接组由代表单个神经元或细胞类型的节点构成，当细胞表达匹配的受体 - 配体对时，节点间通过边相连。大规模反向药理学研究为绘制神经肽网络提供了助力，目前已成功构建了秀丽隐杆线虫（C. elegans）、人类大脑、小鼠皮层、斑马鱼端脑、果蝇时钟电路等的神经肽连接组。
秀丽隐杆线虫是首个完成整个神经系统神经肽连接组构建的生物。其连接组显示，神经肽网络可能比已知的突触连接组连接更紧密，神经元间相互作用多出 10 倍以上，且大多数神经肽通路介导突触外相互作用。此外，秀丽隐杆线虫神经肽连接组具有特定组织特征，如存在具有相似肽能连接性的神经元簇，部分中枢神经元在突触和神经肽连接组中都存在，而有些则是神经肽连接组特有的。而且，不同神经肽 - 受体对的网络拓扑结构多样，包括局部网络、广播网络和普遍网络等。脊椎动物肽网络也有类似拓扑结构，但不同网络架构的功能意义尚待揭示。
对比不同物种基于表达的神经肽网络，发现一些保守特征。肽网络通常密度较高，表明动物大脑中大多数神经元细胞类型通过神经肽信号相互连接。神经肽通路普遍共表达，存在多种相互作用方式，如肽能串扰、收敛信号、发散信号、神经肽级联反应和自分泌信号等。体内研究也证实了这些相互作用，例如激活肽 GPCRs 可调节同一神经元中其肽配体和 / 或其他神经肽的释放。此外，受体 - 配体配对的混杂性也会导致肽能串扰。不过，目前尚不清楚神经肽是冗余的还是具有累积作用，未来可通过类似秀丽隐杆线虫的组合突变库表型分析策略来探究共表达神经肽和 GPCRs 的相互作用。
测量神经肽活动 —— 时空解析的肽网络
神经肽信号网络的复杂性促使人们开发专门工具，以实现对神经肽传递的时空监测。由于缺乏特异性体内传感器，确定基于表达的神经肽相互作用是否具有功能以及何时发挥功能一直颇具挑战。近年来，多种直接监测神经肽传递的工具不断涌现，推动了人们对神经肽信号的时间动态、释放部位以及细胞整合等方面的理解。
在测量神经肽释放方面，已开发出多种光学方法。例如，通过基因标记使肽携带 pH 敏感的荧光指示剂，可报告分泌小泡（DCVs）在胞吐过程中的 pH 变化，结合全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，能够时空分辨单个释放事件。还有将神经肽标记荧光团激活蛋白（FAPs），使其与细胞外应用的膜不透性荧光团接触后发出荧光，用于可视化果蝇大脑中 DCV 的胞吐作用。此外，一种不干扰内源性肽能信号的 DCV 释放通用传感器也已问世，它由连接在 DCV 特异性膜蛋白 CYB561 腔侧的 pH 敏感 GFP 变体构成。这些工具对于解析肽网络中神经肽释放的时间动态和区域化非常有用，如研究发现果蝇时钟神经元从神经末梢或胞体释放神经肽的机制不同，进而控制节律行为的不同方面。
在研究神经肽与受体结合方面，基因工程改造的能报告肽结合的 GPCRs 为体内研究神经肽传递提供了多种工具。基于荧光 GPCR 的传感器可监测神经肽释放后的传播位置、距离和速度，有助于验证基于表达的神经肽相互作用是否具有功能。这些传感器通过在 GPCR 的细胞内环插入荧光蛋白构建而成，当与目标神经肽结合时，受体发生构象变化，导致荧光发射增强。目前已开发出针对多种神经肽的传感器，如哺乳动物的食欲素、催产素、生长抑素、阿片类物质以及果蝇的短神经肽 F 等。这些传感器灵敏度高、结合动力学快，可实时监测自由活动动物体内的内源性神经肽信号，例如利用催产素荧光 GPCR 传感器发现了自由活动小鼠体内催产素水平的超昼夜振荡以及交配过程中催产素肽的区域化释放。此外，这些传感器还能测量神经肽在细胞外空间的时空扩散，有研究表明神经肽可在数秒内到达距离释放位点 100μm 以外的受体。
实时荧光 GPCR 传感器虽能报告受体与肽配体的结合，但无法反映细胞内信号传导。转录 GPCR 活性整合器则可通过将受体的细胞内信号级联与转录报告基因的产生相耦合，标记 GPCR 被激活的细胞。具体来说，GPCR 的 C 末端通过烟草蚀纹病毒（TEV）蛋白酶切割位点与非天然转录因子融合，当配体激活受体后，与 β - 抑制蛋白（受体激活后招募的蛋白）融合的 TEV 蛋白酶靠近其靶序列，释放转录因子，诱导报告基因表达。在黑暗中通过光敏感的 LOV 蛋白封闭 TEV 蛋白酶切割位点，可进一步提高时间分辨率。虽然该工具常用于监测培养细胞中的 GPCR 激活，但在体内研究神经调质信号传导方面应用较少，不过其具有稳定报告大量细胞中受体激活的优势，未来有望在进一步改进后更多地应用于体内研究。
监测 G 蛋白激活下游的第二信使（如钙、环磷酸腺苷（cAMP）和二酰甘油）水平变化，是测量肽 - GPCR 信号功能反应的直接方法。目前，细胞质游离钙是最常被记录的第二信使，大量钙成像研究揭示了神经肽通过影响神经活动调节大脑功能的多种方式。近期技术进展使得在自由活动动物中进行大体积钙记录并结合光学神经元刺激成为可能，研究发现神经肽信号对神经元群体动态有广泛影响，可调节行为状态下的持续神经活动模式，如小鼠的攻击行为和秀丽隐杆线虫的持续觅食状态，还能在较短（< 秒）时间尺度上影响大规模群体动态。不过，由于测量其他第二信使（如 cAMP 和二酰甘油）的传感器尚未在脑尺度上系统应用，目前对神经肽网络对神经功能影响的了解可能仍低估了其实际作用。
将上述工具结合使用，可关联神经肽作用的不同生理方面，甚至同时追踪多种神经肽的作用。例如，一项研究同时使用实时 GPCR 和 cAMP 传感器，发现下丘脑靶神经元整合了神经肽 Y 和 α - 促黑素细胞激素（αMSH）的随机信号，通过对 cAMP 信号的相反作用来校准饱腹感速率。同时可视化多种神经肽和其他神经活性分子的作用，为剖析大脑回路中的信息处理提供了新方法，有助于深入理解神经肽网络的机制和功能原理。
神经肽信号网络的重塑 —— 肽能可塑性
目前对基于表达的神经肽网络的计算机模拟（in silico）和功能分析，大多将神经肽连接组视为叠加在神经解剖结构上的静态结构，但实际上神经肽和受体表达的瞬时或持续变化会对这些网络的结构和功能产生广泛影响。
在发育过程中，神经肽网络可能会发生重塑。在脊椎动物中，从出生到成年大脑经历的广泛功能和结构变化，伴随着神经肽（如甘丙肽）表达的改变，这些变化有助于神经回路的成熟。在秀丽隐杆线虫中，胚胎后神经系统发育过程中神经肽表达的时间调控，支撑着探索行为的时间转变。
除了发育程序，神经肽表达还受经验和性别影响。秀丽隐杆线虫性别特异性基因表达图谱显示，许多神经肽和受体存在性别二态性表达，这在某些情况下决定了其在应激反应或联想学习等行为中的性别特异性作用。神经元转录组也显示，感官经验或体内平衡破坏（如睡眠剥夺）会导致神经肽表达发生广泛变化。虽然对这类肽能可塑性的网络分析尚少，但可能有助于揭示肽网络的适应性特征或核心保守元件。
对比不同物种的神经肽网络也能获得相关见解。神经肽基因表达可能快速进化，例如在密切相关的果蝇物种中，编码色素分散因子（PDF）的神经肽基因的调控变化是昼夜节律可塑性进化的热点。对三种秀丽隐杆线虫物种神经系统的基因表达比较，也揭示了神经肽和受体表达的显著进化变化模式。尽管在单个基因水平存在广泛差异，但神经肽网络的整体拓扑结构是保守的，不同物种中许多神经元间连接由不同的神经肽 - 受体对介导。这表明神经肽网络结构与功能密切相关，即使神经肽信号适应不同生态需求，其核心功能的某些方面仍得以维持。随着更多不同物种和情境下的转录组数据集出现，比较分析将进一步揭示肽网络架构的共同原则。
结论
近期的研究进展为理解神经系统的结构和功能开启了新阶段。神经肽回路被越来越多地视为动物大脑的基本组成部分，其广泛的网络在无脊椎动物和脊椎动物中均有绘制。神经肽不仅是生理和行为的重要调节因子，其几乎连接所有神经元的特性，也凸显了它们在神经系统功能中的重要作用，既作为调节快速神经递质作用的调制信号，又在复杂行为中充当主要信息传递者。神经肽网络的高密度表明其在控制回路活动和行为方面的重要作用，尽管在脊椎动物中对局部肽能回路的探索较少，但已有证据显示其对学习等复杂行为至关重要。此外，神经肽系统在分子和功能上存在深度保守性。未来，进一步比较研究无脊椎动物和脊椎动物的神经肽网络，有望揭示神经系统功能的基本原理。
当前主要挑战之一是揭示密集神经肽网络的运作原理。这需要将目前主要针对单一通路的功能研究扩展到网络活动分析。新开发的针对不同肽和受体信号级联的体内传感器，结合神经肽信号图谱，将有助于理解神经元如何处理具有相似或相反作用的同时存在的神经肽信号。未来系统探索神经肽 - 受体通路对细胞生理学影响的工作也将为此提供帮助。另外，考虑到肽能可塑性会改变网络结构，研究哪些神经肽相互作用在何时可及也是关键。神经肽释放报告器和基于 GPCR 的传感器的发展，为研究神经肽信号的时空范围相关过程（如区域化释放、扩散和降解）提供了途径。最终，将神经肽传递的时空模式与解剖结构、神经回路和行为相关联的综合方法和计算模型，将为揭示神经肽如何控制大脑内部状态和行为带来新的可能。
