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本文聚焦单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析膜蛋白结构的研究。阐述了膜蛋白结构研究的难点，cryo-EM 的技术优势、样品制备与数据分析的进展，以及能获取的研究成果，对推动膜蛋白相关研究和生物医学发展意义重大。
引言
膜蛋白在细胞的信号转导、物质运输、细胞通讯等各类生命活动中发挥着关键作用，约占人类蛋白质组的 30%，还是超 60% 治疗药物的作用靶点。然而，因其自身稳定性差和两亲性（同时具有疏水和亲水区域）的特点，膜蛋白的生化纯化和结晶困难重重，使得高分辨率结构解析进展缓慢。
传统的 X 射线晶体学和核磁共振光谱技术，在解析膜蛋白结构时存在显著局限，它们对大量稳定且均一的样品需求较高。近年来，单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析（SPA）技术为膜蛋白结构研究带来了突破，该技术无需结晶就能在近天然状态下观察蛋白质，随着先进直接电子探测器和复杂图像处理算法的发展，cryo-EM 分辨率大幅提升，如今已能解析大型、动态且灵活的膜蛋白结构。在蛋白质数据库中，2014 年由 cryo-EM 解析的膜蛋白结构占比仅 1%，近年来这一比例已飙升至 80% 以上。
膜模拟物的选择
纯化后的膜蛋白需要在模拟生物膜特性的膜模拟系统中进行稳定和溶解。常用的膜模拟物有去污剂、两亲性聚合物（amphipols）、纳米圆盘（nanodiscs）和脂质体等。其中，去污剂因操作简单且常用于蛋白质提取而备受青睐，临界胶束浓度（CMC）较低或背景干扰小的去污剂更为常用。
冷冻电镜膜蛋白样品的常见问题
尽管有多种方法可用，但新膜蛋白的 cryo-EM SPA 样品制备仍是结构测定的一大瓶颈。用于稳定膜蛋白的两亲性分子会带来诸多问题，比如过量去污剂会产生大量空胶束颗粒，增加背景噪音，影响数据质量；使用脂质纳米圆盘时也存在类似问题，这些都会干扰对膜蛋白结构的准确解析。
SPA 数据分析的进展
膜蛋白 SPA 数据分析流程与可溶性蛋白相似，常用软件有 Relion 和 CryoSPARC。主要步骤包括预处理（运动校正和对比度传递函数估计）、颗粒挑选、通过二维和三维分类进行颗粒筛选，以及最终的三维重建。不过，由于膜蛋白样品信噪比低，颗粒挑选难度较大。
原位单颗粒分析
原位 SPA 技术可在天然细胞环境或完整生理环境下观察蛋白质，为结构生物学开辟了新方向，已成功应用于核糖体等可溶性蛋白研究，无需生化纯化就能在细胞内进行观察。但由于膜蛋白的异质性、低丰度等问题，该技术在膜蛋白研究中的应用仍面临挑战。
从膜蛋白冷冻电镜结构中能获得什么？
随着硬件和软件的不断进步，cryo-EM SPA 将持续助力解决复杂生物学问题，主要集中在以下五个关键领域：
- 水分子和配体的可视化：分辨率接近 2 ? 的 cryo-EM 结构能清晰呈现蛋白质周围水分子和配体的信息，这对理解蛋白质的功能机制、药物结合位点及作用方式意义重大。例如，通过观察配体与膜蛋白的结合模式，能为药物设计提供精准依据。
- 膜蛋白动态分析：借助 cryo-EM，可实时捕捉膜蛋白在不同状态下的动态变化，包括构象改变、亚基间的相互作用等。这些动态信息有助于揭示膜蛋白在执行功能过程中的分子机制，比如离子通道蛋白如何在信号刺激下开合。
- 结合伴侣相互作用研究：研究膜蛋白与结合伴侣的相互作用，能深入了解细胞内的信号传递和代谢调控网络。明确膜蛋白与伴侣蛋白的结合位点和结合强度，有助于解释细胞生理过程的调控机制，为开发干预相关疾病的药物提供潜在靶点。
- 脂质关联分析：膜蛋白与脂质的相互作用对其功能和稳定性至关重要。cryo-EM 可解析膜蛋白与周围脂质的结合方式和作用区域，揭示脂质如何影响膜蛋白的折叠、定位和活性，为理解膜生物学的基本原理提供依据。
- 对电化学梯度的响应研究：在生物膜中，电化学梯度驱动着许多重要的生理过程。通过 cryo-EM 研究膜蛋白在电化学梯度变化时的结构变化，有助于阐明离子运输、能量转换等过程的分子机制，为相关疾病的病理研究和治疗策略开发提供理论支持。
总之，cryo-EM 技术在膜蛋白结构研究领域不断取得突破，通过优化样品制备、改进数据分析方法和拓展研究方向，将为基础生物学研究和转化医学应用提供更多关键信息，推动生命科学和健康医学的发展。
