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本文聚焦非规范核小体，介绍了六聚体核小体（hexasome）、H3-H4 八聚体核小体（H3-H4 octasome）等多种类型。阐述它们在染色质重塑、转录等过程中的作用机制，为深入理解染色质相关调控提供重要依据。
引言
真核生物中，基因组 DNA 被包装成染色质，核小体是其基本结构单位。核小体并非单一静态实体，而是动态多样的。经典核小体由约 150bp 的 DNA 与组蛋白 H2A、H2B、H3、H4 紧密结合而成。其中，H2A 和 H2B 形成异二聚体（H2A-H2B dimers），H3 和 H4 形成二聚体的异二聚体（H3-H4 tetramers） ，两个 H2A-H2B 异二聚体和一个 H3-H4 四聚体组装成组蛋白八聚体，DNA 以左手螺旋方式绕组蛋白核心 1.65 圈。除经典核小体外，还有非规范核小体，其在染色质相关调控中发挥关键作用，但作用机制尚不明确。本文将总结非规范核小体的结构和功能，重点探讨其在转录中的作用。
六聚体核小体（Hexasome）
六聚体核小体由一个 H2A-H2B 二聚体和一个 H3-H4 四聚体组成。研究发现，与 RNA 聚合酶 II（RNAPII）相关的核小体核心中，H2A 和 H2B 的含量约为 H3 和 H4 的一半。冷冻电镜研究表明，六聚体核小体可能在 DNA 复制过程中，与组蛋白伴侣 FACT 共同形成。此外，多个染色质重塑复合物，如 SWR1、INO80 和 Chd1 等，都能与六聚体核小体相互作用。在果蝇细胞中，非规范核小体，包括六聚体核小体，在转录起始位点（TSS）下游的 + 1 核小体处富集，不过 FACT、INO80、SWR1 和 Chd1 在六聚体核小体动态变化中的具体作用还有待进一步明确。
H3-H4 八聚体核小体（H3-H4 octasome）
在核小体组装过程中，H3-H4 四体（含有一个 (H3-H4)2四聚体和约 70bp 的 DNA）被认为是中间状态，之后组蛋白伴侣会沉积两个 H2A-H2B 二聚体。除了 H3-H4 四体，体外还重建了 H3-H4 八聚体核小体，它含有两个 (H3-H4)2四聚体。冷冻电镜分析显示，H3-H4 八聚体核小体具有独特结构特征，两个 H3-H4 四聚体对称组装，包裹约 120bp 的 DNA，在二聚体区域，两个 H4 分子形成了一种新型的四螺旋束，这与经典核小体中两个 H3 分子在二聚体区域形成四螺旋束的结构不同。而且，H3-H4 八聚体核小体具有多种构象，比经典核小体更具灵活性。在酿酒酵母中，通过基于结构的组蛋白 - 组蛋白交联实验证实了 H3-H4 八聚体核小体的存在，但其细胞功能仍有待进一步研究。
重叠二聚核小体和三聚核小体
SWI/SNF 染色质重塑因子可重新定位核小体，使其与相邻核小体发生碰撞，诱导形成 altosome，即两个核小体相互碰撞的结构。这种结构也可通过含有 Widom 601 序列串联重复的 250bp DNA 片段重建。X 射线晶体学确定了重建的 altosome 结构，它由六聚体和八聚体核小体单元组成，被称为 “重叠二聚核小体”（OLDN） ，该结构中六聚体和八聚体单元紧密相连，无连接 DNA，可能会影响 RNAPII 通过、核小体重新定位等染色质动态过程。类似地，由一个八聚体和两个六聚体单元组成的重叠三聚核小体，可在 350bp DNA 片段上形成。近期研究发现，染色质重塑因子 Chd1 与 OLDN 相互作用，可能与组蛋白伴侣 FACT 协同作用，促进其解聚，Chd1 在 OLDN 处理中的功能将在后续章节探讨。
端粒四聚核小体
端粒的维持对于保护染色体末端、防止降解和错误的 DNA 修复事件至关重要。哺乳动物端粒重复序列 TTAGGG 对招募端粒特异性结合因子至关重要。对重建的具有代表性端粒 DNA 序列的四聚核小体进行冷冻电镜分析发现，端粒 DNA 的四聚核小体呈柱状排列，核小体堆叠，核小体重复长度约为 132bp。此外，还观察到端粒 DNA 四聚核小体的另一种开放构象，即一个外部核小体未堆叠并向外翻转。这些不同的寡聚核小体构象可能在招募端粒特异性结合因子（如 TRF1）和调节端粒功能方面发挥作用。
RNAPII 延伸复合物通过核小体形成非规范核小体
核小体结构是转录的物理屏障，限制了 RNAPII 对基因组 DNA 的访问，克服这一屏障在转录的表观遗传调控中至关重要。在转录延伸过程中，RNAPII 会将核小体 DNA 从组蛋白八聚体表面剥离。转录时，RNAPII 会在特定的超螺旋位置（SHLs）暂停，如 SHLs（-6）、（-5）、（-2）和（-1） ，表明这些位置存在阻碍其前进的关键组蛋白 - DNA 相互作用。Spt4/5 和 Elf1 转录延伸因子可通过减少 RNAPII 与核小体的直接接触，促进转录延伸。结构研究表明，在 RNAPII 前进到 SHL（-1）位置之前，核小体中的所有组蛋白都保持完整。然而，另一个 RNAPII - 核小体复合物的冷冻电镜结构显示，回溯的 RNAPII 延伸复合物（EC）可与缺少启动子近端 H2A-H2B 二聚体的六聚体核小体结合。近期研究还表明，非回溯复合物中也可形成六聚体核小体，这意味着 H2A-H2B 二聚体的丢失可能由多种因素触发，包括组蛋白伴侣、DNA 从组蛋白核心释放以及某些体外离子条件等。因此，在各种转录延伸条件下，核小体可转变为六聚体核小体状态，这拓宽了人们对 RNAPII 如何克服核小体屏障的理解。
RNAPII EC 通常含有多种转录延伸因子，如 Paf1C、Spn1、Spt6、Spt4/5 和 Elf1 等，它们有助于在核小体解聚的情况下促进转录延伸。组蛋白伴侣 FACT 在协助核小体转录和促进转录延伸过程中 RNAPII 上游的核小体重组方面发挥着关键作用。EC - 核小体 - FACT 复合物的冷冻电镜结构显示，当 EC 位于核小体的 SHL（-1）和 SHL（0）位置时，FACT 与位于 EC 下游的核小体结合。而当 EC 穿过原始下游核小体的二聚体位置时，组蛋白复合物会转移到 EC 的上游 DNA 区域。FACT 与 EC 后面含有一个 H2A-H2B 二聚体和一个 H3-H4 四聚体的重组六聚体核小体（称为 EC58hex）结合。Paf1C 的延伸因子 Spt4/5、Spt6、Leo1 和 Rtf1 形成一个 “支架”，容纳重组的六聚体核小体。随着 EC 的前进，几乎完整的核小体会在 EC 的上游区域重新组装。此外，在延伸因子存在的情况下，基于 FACT 的六聚体核小体重组也有报道。这些发现表明，延伸因子有助于在转录延伸过程中稳定 FACT 结合的上游六聚体核小体，SPT6 可与结合在重组六聚体核小体上的 FACT 结合，并且在核小体组装完成时，通过其 N 端区域与核小体组蛋白相互作用，酵母 Spt6 的 N 端区域可直接与 H2A-H2B 二聚体相互作用并控制染色质结构，研究 FACT 和 Spt6 在 RNAPII 转录核小体过程中的独特和协同作用很有意义。
含六聚体核小体复合物的结构和功能
FACT 是一种重要的组蛋白伴侣，由 SPT16 和 SSRP1 两个亚基组成。它可促进部分核小体解聚，通过置换 H2A-H2B 二聚体，同时促进核小体重组，并协助聚合酶穿过染色质，维持核小体结构。FACT - 六聚体核小体复合物的冷冻电镜结构显示，FACT 与核小体 DNA 和组蛋白核心都有广泛的相互作用，特别是通过 SPT16 的羧基末端结构域直接与核小体 DNA 相互作用，并连接 H2A-H2B 二聚体。该结构表明，FACT 与六聚体核小体之间的广泛相互作用有助于稳定转录过程中瞬时形成的亚核小体状态，通过核小体重组维持染色质完整性。
近期，多种染色质重塑因子与六聚体核小体复合物的冷冻电镜结构已被报道，这阐明了六聚体核小体的不对称性影响染色质重塑因子功能的分子机制。酿酒酵母中的染色质重塑因子 INO80 含有 Ino80 ATP 酶亚基和 14 个其他亚基，相较于核小体，它更倾向于以六聚体核小体为底物。INO80 通过滑动调节亚核小体的正确定位，防止远端启动子区域的隐秘转录。INO80 - 六聚体核小体复合物的冷冻电镜结构显示，由于缺少 H2A-H2B 二聚体而暴露的六聚体核小体的 H3-H4 表面，形成了一个与 INO80 亚基 Arp5 结合的特定界面，这对其重塑活性至关重要。在该复合物中，六聚体核小体的 DNA 足迹发生改变，与组蛋白结合的长度为 101bp，并且出现了六聚体核小体特异性的构象变化，如组蛋白 H4 的 β - α 转换。这些结构特征为自旋旋转模型提供了基础，在该模型中，INO80 旋转约 145°，将其 ATP 酶马达转移到 SHL - 3 位置，通过识别暴露的 H3-H4 界面而非 H2A-H2B 酸性补丁来促进重塑。
SWR1 是 INO80 家族的成员，是一种由 14 个亚基组成的染色质重塑复合物，可促进核小体中的组蛋白交换。在酿酒酵母中，SWR1 催化核小体中 H2A-H2B 二聚体与 Htz1-H2B 二聚体（人类中 Htz1 的同源物是 H2A.Z）的替换。近期的冷冻电镜分析揭示了 SWR1 - 六聚体核小体复合物的结构，其中 Swc5 亚基稳定了剥离的 DNA 和暴露的六聚体核小体组蛋白核心。此外，还报道了 SWR1 - Chz1 - 核小体复合物的结构，在该结构中，组蛋白伴侣 Chz1 与整合到核小体中的 Htz1-H2B 二聚体结合，表明 Chz1 促进了 Htz1-H2B 二聚体的整合。这些结构解释了 SWR1 稳定六聚体核小体中间体并随后促进 Htz1-H2B 二聚体整合的机制。
重叠二聚核小体的形成和分解
近年来，结构生物学、生物化学和基因组分析的进展极大地拓展了人们对 OLDN 形成机制的理解，并提出了一些假设模型。第一种模型认为，染色质重塑因子在 TSS 处诱导 OLDN 形成。实际上，SWI/SNF 染色质重塑复合物的重塑作用可能在酶促方面促进 OLDN 的形成。HeLa 细胞中的微球菌核酸酶测序（MNase - seq）实验表明，TSS 周围约 250bp 的 DNA 受到保护，这些受保护的 DNA 片段可能代表 OLDN 形成的足迹。基于此，提出了一种模型，即染色质重塑因子重塑 TSS 处的 + 1 核小体，诱导其与下游核小体碰撞，释放一个 H2A-H2B 二聚体，从而形成 OLDN。然而，染色质重塑因子促进 OLDN 形成以及 RNAPII 转录通过 OLDN 的精确分子机制仍有待阐明，需要进一步研究。
第二种模型认为，当 RNAPII 将组蛋白从其下游转移到上游区域时，转录会诱导 OLDN 形成。在酿酒酵母中，化学染色质切割和测序研究表明，OLDN 作为活跃转录基因核小体转录的副产物，在 RNAPII 上游形成。此外，染色质重塑因子 Chd1 和 Isw1 的敲除导致 OLDN 形成产生的富集峰增加，这表明 Chd1 和 Isw1 在活跃转录的基因组区域中，对 RNAPII 转录形成的 OLDN 的分解起作用。Chd1 是酵母中唯一的染色质结构域解旋酶 DNA 结合蛋白，主要与核小体组装和间距相关。Chd1 特异性定位于基因体，可能通过与 RNAPII EC 的组件、组蛋白甲基转移酶和 / 或组蛋白伴侣 FACT 相互作用，在转录延伸过程中发挥作用。冷冻电镜分析提出了 Chd1 分解 OLDN 的模型，在 Chd1 - OLDN 复合物中，Chd1 与 OLDN 结合，使重塑因子能够将六聚体核小体从核小体上移开。此时，Chd1 的 DNA 结合结构域与核小体末端的突出 DNA 结合，使重塑因子处于非活性状态。FACT 复合物将一个 H2A-H2B 二聚体组装到六聚体核小体中，OLDN 被重塑为两个单独的核小体。由 OLDN 衍生的两个核小体随后可能会被重塑，从而调整核小体间距。
展望
对含有非规范核小体的复合物的结构研究，推动了人们对染色质动力学的理解，尤其是在转录调控和染色质重塑方面。非规范核小体显著增加了染色质单元的结构多样性，这可能会影响染色质的高级结构。染色质结构和动力学的差异在表观遗传基因组调控中可能起着核心作用。未来利用先进的冷冻电镜技术在体外和体内进行的研究，有望进一步阐明这些过程。
