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本文聚焦氢 / 氘交换质谱（HDX-MS）在早期药物研发中的应用。介绍其技术原理、在大小分子药物发现、高通量筛选及基于动力学的药物发现中的应用，探讨未来发展方向，对药物研发领域研究人员极具参考价值。
HDX-MS 在早期药物发现中的演变作用
在药物研发领域，了解蛋白质功能对于攻克复杂疾病至关重要。蛋白质的功能依赖于其动态变化，然而传统方法难以获取蛋白质动力学信息。近年来，尽管静态蛋白质结构模型因冷冻电镜（cryo-EM）的分辨率提升和 AlphaFold2（AF2）的发布而更易获得，但蛋白质动力学在药物发现中的关键作用仍常被忽视。氢 / 氘交换质谱（HDX-MS）技术的出现，为获取蛋白质动力学信息提供了有力手段。
HDX-MS 技术基于蛋白质主链酰胺位置的质子与环境中的质子不断交换的原理。当使用氘代溶剂时，氘核会部分取代质子进入蛋白质主链。通过酸化终止反应，再用酸稳定的蛋白酶进行蛋白水解，由于氘核比质子重，利用质谱就能定量蛋白质中不同位点的氘掺入量，进而反映蛋白质的局部动力学变化。
该技术具有诸多优势，它是一种基于溶液的方法，无需对蛋白质进行预先标记、修饰或固定化处理，能在接近天然的环境中监测蛋白质，这使得它可用于研究从内在无序蛋白、大型蛋白质复合物（包括膜蛋白复合物），到整个病毒颗粒和大型蛋白质 - 核酸复合物等复杂体系。
过去二十年，HDX-MS 技术取得了显著进展。集成的液相色谱 / 质谱（LC/MS）模块、多种兼容的消化酶、自动化工作流程解决方案以及专门的数据分析软件不断涌现，这些进步使 HDX-MS 从少数实验室的专业技术，逐渐发展为学术界和工业界广泛应用的技术。
HDX-MS 在大分子和小分子药物发现中的应用
在大分子药物发现方面，治疗性抗体的研发中，表位作图是关键步骤。X 射线晶体学和冷冻电镜能提供高分辨率的抗原 - 抗体相互作用图谱，但对于确定构象表位有一定局限性。肽阵列或噬菌体展示技术通量较高，但分辨率较低，且在识别构象表位上效果不佳。HDX-MS 可在中高通量水平上同时表征线性和构象表位，还能在接近天然的环境中研究抗原 - 抗体相互作用，弥补了其他技术的不足。例如，利用 HDX-MS 研究中和抗体与登革热和寨卡病毒颗粒上隐蔽表位的结合，为抗体研发提供了重要信息。
在小分子药物发现领域，HDX-MS 常用于表征蛋白质 - 小分子相互作用。早期研究主要关注高亲和力配体与蛋白质靶点的结合，如今它也用于研究弱结合配体甚至片段分子的结合位点。对于大型蛋白质靶点，多个不同的结合口袋可能存在，确定小分子结合位点对优化药物分子至关重要。然而，HDX-MS 无法直接确定配体的结合姿势，将其与计算化学相结合可解决这一问题。通过 HDX-MS 确定结合位点后，计算方法可预测配体的潜在结合姿势。若有蛋白质的高分辨率结构，可利用刚性或柔性对接方法预测，如 Li 等人预测天然产物抑制剂与甘油醛 3 - 磷酸脱氢酶（GADPH）的结合姿势。随着 AF2 的出现，更多蛋白质结构模型可获取，为预测结合模式提供了便利，但仍需通过分子动力学（MD）模拟评估模型的稳定性，并验证其能否解释结构 - 活性关系。
HDX-MS 作为高通量筛选流程的一部分
药物发现的首要环节是识别具有功能活性的分子，通常通过高通量筛选（HTS）实现，包括功能测定、表型测定、结合测定或虚拟筛选等方法。然而，现有筛选方法存在局限性，如功能和表型测定假阳性率高，结合测定虽能识别结合分子，但对其功能信息提供有限。将 HDX-MS 与传统筛选方法相结合，可发挥重要作用。例如，在筛选维生素 D 受体的片段分子时，先用高通量筛选获得潜在片段，再用 HDX-MS 评估，筛选出与同源配体结合位点相同的片段，提高筛选效率。对于蛋白质 - 蛋白质相互作用调节剂的开发，HDX-MS 可在确定 “热点”（即对结合自由能有贡献的蛋白质 - 蛋白质界面）后，优化筛选仅在这些特定位点结合的配体。
HDX-MS 作为基于动力学的药物发现工具
传统的基于亲和力的药物研发方法在面对变构靶点时存在局限，提高亲和力并不一定能提升药物效力。基于动力学的药物发现是一种新兴范式，它将蛋白质构象动力学信息与静态结构信息相结合，旨在筛选、优化和推进那些能与靶蛋白结合并诱导最佳构象动力学输出，进而产生功能效应的化合物。
HDX-MS 在解析同源配体诱导的变构效应，并将其与蛋白质功能直接关联方面发挥着重要作用。以 RORγ 激活的研究为例，HDX-MS 监测发现 RORγ 的激活与螺旋 12 的稳定相关。在测试一组化合物时，多数化合物结合在正构位点，但只有那些能强烈稳定螺旋 12 的化合物才是激动剂，部分激动剂对螺旋的稳定作用较弱，拮抗剂则不改变螺旋 12 的动力学。通过这种方式，可基于 “正确” 的动态特征筛选和推进化合物。
未来展望
目前，在结构背景下解释 HDX-MS 获得的动力学数据，常将肽分辨率的氘化水平差异数据映射到蛋白质的单一静态三维模型（实验或预测模型）上。当蛋白质有多种已知结构状态时，这种方法有助于从结构上解释氘化变化，但在仅有单一构象模型时，解释动力学变化就较为困难。
计算建模与 HDX-MS 的结合可有效解决这一问题。例如，HDX 集合重加权（HDXer）软件包，可对已生成的结构集合进行重加权，提取与实验 HDX-MS 数据相符的子集。在某些蛋白质研究中，HDXer 已成功揭示相关结构状态，如在糖转运体研究中，量化了其向内和向外朝向状态的分数群体，展示了抑制剂和底物对转运体结构集合的不同影响。此外，HDXer 还可与配体对接和 MD 模拟结合，获取蛋白质 - 配体结合的高分辨率模型。
尽管 HDX-MS 在药物发现中应用广泛，但仍面临一些挑战。蛋白质用量和快速数据分析的需求限制了其高通量工作流程的实施，且难以区分结合位点和变构效应。未来，随着计算机算力的提升和结构模型获取的便捷性增加，HDX-MS 与计算建模（如 MD 模拟和 HDXer）的结合将更加紧密。人工智能也将助力开发预测算法，将 HDX-MS 数据转化为结构解释，有望推动 HDX-MS 在药物发现领域的进一步应用，使其在结合位点作图和基于动力学的药物发现中发挥更重要的作用。
