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本文聚焦非长末端重复（non-LTR）反转录转座子，通过冷冻电镜（cryo-EM）和生化研究，解析昆虫、脊椎动物 R2 反转录转座子及人类 LINE-1 反转录转座子的结构与转座机制，探讨其在基因组进化和生物学中的意义，为深入研究提供重要依据。
移动反转录转座子蛋白作用机制的结构与生化研究
在生命的微观世界里，有一种神奇的 “遗传小精灵”—— 自主非长末端重复（non-LTR）反转录转座子，长散在核元件（LINE）就是其中的典型代表。它们广泛存在于真核生物中，悄无声息却又深刻地塑造着基因组的面貌，对宿主的生理健康和疾病发展都有着不可忽视的影响。
non-LTR 反转录转座子有着独特的 “复制粘贴” 方式，即靶引物反转录（TPRT）。在这个过程中，反转录转座子编码的蛋白会在靶 DNA 上切开一个小口，以此为引物，以结合的 RNA（通常是自身编码的 mRNA）为模板进行反转录，从而在基因组中创造出新的拷贝。
过去，由于活性复合物的纯化和重组面临诸多挑战，关于 non-LTR 反转录转座子的结构信息一直是个谜。但近年来，随着研究技术的飞速发展，针对昆虫、鸟类、海龟的位点特异性 R2 反转录转座子以及人类 LINE-1 反转录转座子的生化研究和冷冻电镜（cryo-EM）结构解析取得了重大突破，为我们打开了了解它们的新窗口。
昆虫和脊椎动物物种 R2 反转录转座子组件的冷冻电镜结构
R2 反转录转座子是位点特异性元件，专门 “定居” 在多细胞动物基因组中串联重复的 rDNA 基因位点。家蚕的 R2 蛋白（BoMo）一直是研究 TPRT 的重要模型。此前的生化研究虽然知道 R2 蛋白能识别反转录转座子 RNA 的 3′非翻译区（UTR），并在 28S rDNA 位点的第一条靶 DNA 链上切口启动 TPRT，但 TPRT 起始的原子水平机制一直不清楚。
最近两项 cryo-EM 研究揭开了部分神秘面纱，它们展示了 BoMo 在启动 TPRT 时与 3′UTR RNA 和靶 DNA 结合的结构。研究发现，不同 R2 蛋白在 TPRT 过程中有着相似的基本机制，限制性内切酶样（RLE）结构域负责切割靶 DNA 链，切割产生的 3′端会转移到逆转录酶（RT）核心区域，与 3′UTR RNA 碱基配对，进而启动第一条链的合成。
在探索将 R2 编码蛋白用于人类细胞 rDNA 位点转基因插入的过程中，研究人员发现鸟类的 A 进化枝 R2 蛋白（如来自斑胸草雀 Taeniopygia guttata 的 TaGu）在精确转基因递送方面表现出色，而家蚕所属的 D 进化枝 BoMo 在这方面效率较低。
进一步对 TaGu 和来自平胸龟 Platysternon megacephalum 的 A 进化枝 R2 蛋白（PlaMe）进行 cryo-EM 结构测定，发现 A 进化枝和 D 进化枝 R2 蛋白存在一些差异。比如，A 进化枝的 TaGu 和 PlaMe 有三个锌指结构和 Myb 结构域，能与 rDNA 上游更长的区域相互作用，而 D 进化枝的 BoMo 只有一个锌指结构和 Myb 结构域，与 rDNA 的结合区域较小。此外，A 进化枝 TaGu 和 PlaMe 中最 N 端的锌指（ZnF3）还能与 3′UTR RNA 结合。
R2 蛋白还能切割第二条靶 DNA 链，但这个活性在 3′UTR RNA 存在时会受到抑制，当第一条链 cDNA 合成以及模板 RNA-cDNA 双链产生，3′UTR RNA 从初始结合位点脱离后，第二条链切割活性才会被激活。家蚕 R2 RNA 的 5′端有一个折叠基序，可能与 BoMo 相互作用来激活第二条链的切割，但这个特征在其他物种的 R2 中并不保守。研究人员还解析了 PlaMe 在第二条链切割后的结构，发现其 N 端锌指和 Myb 结构域仍与上游靶 DNA 结合，且结合方式与 TPRT 起始复合物类似，不过第二条 cDNA 链合成的具体机制还不清楚。
人类长散在核元件 - 1 反转录转座的生化和冷冻电镜研究
人类 LINE-1 反转录转座子编码两种蛋白：RNA 伴侣 ORF1p 和反转录转座酶 ORF2p 。与 R2 蛋白对靶 DNA 的极端选择性不同，ORF2p 对靶 DNA 的特异性较低，这使得 LINE-1 在人类基因组中广泛插入。
ORF2p 的 N 端有一个类似于参与碱基切除修复的无嘌呤 / 无嘧啶内切酶结构域（APE），它倾向于在 5′ TTTTT/AA 3′的短共有基序处切割。过去，由于 LINE-1 核糖核蛋白的纯化和重组困难，对 LINE-1 反转录转座的生化和结构基础的研究进展缓慢。虽然之前已经有 ORF1p 的三个特定结构域和 ORF2p 的 APE 结构域的 X 射线晶体结构报道，但对全长 ORF2p 与核酸相互作用的整体认识还很缺乏。
近期三项 cryo-EM 研究取得了重要进展，其中 Baldwin 等人利用细菌表达系统纯化了缺少 N 端 APE 结构域和 C 端结构域（CTD）的 ORF2p 蛋白核心，并确定了核酸底物在 ORF2p RT 活性位点结合的结构。另一项研究通过在大规模昆虫细胞培养中过表达并纯化全长 ORF2p，利用生化和 cryo-EM 技术揭示了 LINE-1 反转录转座的新机制。研究发现，模板 RNA 的 poly (A) 尾与 ORF2p 的多个结构域相互作用，包括 N 端延伸基序（NTEs）、APE 内切酶结构域（EN）连接子以及 CTD，形成了序列特异性的接触。此外，Alu 或合成 RNA 中的茎环结构通过静电相互作用与 ORF2p 结合，这种结合有助于定位 Alu RNA 的 poly (A) 尾，从而启动 TPRT。
生化分析表明，ORF2p 的 DNA 切割和 TPRT 活性在特定条件下才会被极大地激活。当 TTTTT/AA 切割位点位于靶双链 DNA（dsDNA）的 5′端附近，且 5′端有一段 27 个核苷酸（nt）的单链 DNA（ssDNA）区域时，ORF2p 的活性最高，更短的 ssDNA 突出对其活性的刺激作用则小得多。通过结构分析推测，ORF2p 的 CTD 与切割位点上游的 dsDNA 之间的空间位阻可能是导致这种偏好性的原因。后续研究也证实，ORF2p 在完全双链的靶 DNA 上几乎没有 TPRT 活性，而在有最小 7 nt ssDNA 5′突出的靶 DNA 上能检测到 TPRT 活性。这一结果很好地解释了为什么 LINE-1 反转录转座子在细胞周期的 S 期、在滞后链模板上插入的偏好性，因为这些区域存在丰富的 5′ ssDNA 突出结构，且 ORF2p 与增殖细胞核抗原（PCNA）相互作用，而 PCNA 在 DNA 复制过程中发挥着重要作用。
Ghanim 等人还测定了 ORF2p 与双链切割的靶 DNA 结合的 cryo-EM 结构，发现切割的第二条链密度与未分配的单链 RNA 密度相连，进而与 ORF2p RT 活性位点的模板 RNA 相连。不过，由于 ORF2p 无法在双链靶 DNA 上进行第一次切割，这种双链 DNA 结合模式的生理意义还需要进一步探究。此外，ORF2p 与 PCNA 的结合方式也存在多种可能，既有最初定义的结合基序，也有 AlphaFold3 预测的新结合位点，明确这些不同的结合模式对理解 LINE-1 反转录转座机制至关重要。
反转录转座机制的进化方面
对比原核生物和真核生物 non-LTR 反转录元件的反转录转座机制，能发现一些有趣的异同点。相同的是，两者都利用 DNA 切割事件来引发反转录元件 RNA 的反转录，但它们使用的底物有所不同。随着进化，真核生物反转录转座子 RNA 的结构变得越来越简单。从具有复杂折叠结构的 II 型内含子 RNA，到结构相对简化的真核生物 R2 转座子 RNA，再到人类 LINE-1 主要识别 poly (A) 序列的 RNA，复杂性逐渐降低。与此同时，反转录元件编码的蛋白质在数量、大小和结构域复杂性上都有所增加，它们在定义 TPRT 的靶 DNA 特异性方面发挥着越来越重要的作用。
值得注意的是，某些 II 型内含子会利用 DNA 复制叉产生的滞后链 DNA 模板和冈崎片段进行插入，这与人类 LINE-1 的插入方式相似。实际上，许多原核生物的移动元件都善于利用滞后链上的 “弱点”，比如冈崎片段引物暴露的 3′ OH、暴露的 ssDNA 或复制相关蛋白的存在，来实现自身的靶向插入。
结论和未解决的问题
近期对昆虫和脊椎动物 R2 反转录转座子蛋白以及人类 LINE-1 ORF2p 的 cryo-EM 和生化研究，极大地推动了我们对真核 non-LTR 反转录转座子插入机制的结构和功能理解，为进一步研究奠定了坚实的基础。但目前仍有许多未解之谜。例如，活性反转录元件 RNA: 蛋白质复合物是如何组装以实现有效的反转录转座的？虽然推测这一过程可能涉及共翻译组装，遵循 “顺式偏好” 机制，但这种机制在人类 LINE-1 核糖核蛋白组装中的普遍性还有待验证。此外，ORF1p 在 LINE-1 反转录转座过程中的具体作用还不明确，它被认为是 LINE-1 mRNA 的 RNA 伴侣，但对 Alu RNA 的反转录转座却不是必需的。最后，反转录转座过程中产生的 DNA 损伤是如何修复，从而稳定插入新的反转录转座子拷贝的，这一过程也仍然是个谜。未来，还需要更多的生化、功能和结构研究来揭示这些关键步骤，让我们更深入地了解真核生物反转录转座机制。
