综述：冷冻电镜揭示Cullin RING E3连接酶泛素化机制

这篇综述系统阐述了冷冻电镜（cryo-EM）技术如何突破传统结构生物学局限，解析Cullin RING E3连接酶（CRLs）的动态构象与泛素化机制。文章重点探讨了CRL4-CRBN复合物的构象调控、"rock-and-roll"底物受体交换机制，以及UBE2R2介导的多聚泛素链延伸过程，为靶向蛋白降解（TPD）药物开发提供了结构基础。

　　

冷冻电镜照亮泛素化机制：从静态结构到动态全景

引言

泛素-蛋白酶体系统（UPS）作为真核细胞的核心蛋白质量控制体系，通过ATP驱动的泛素化级联反应调控80%以上的哺乳动物蛋白降解。在这个精密系统中，E3连接酶凭借600余种成员的庞大家族实现底物特异性识别，其中Cullin RING连接酶（CRLs）通过模块化组装形成200多种复合体，成为最大的E3家族。传统X射线晶体学和核磁共振（NMR）技术虽能提供原子分辨率结构，却难以捕捉CRLs的动态异质性——这一技术瓶颈随着冷冻电镜（cryo-EM）的革命性进展被彻底打破。

从静态快照到动态洞察：CRBN的构象调控

CRL4-Cereblon（CRBN）复合体因免疫调节药物（IMiDs）的重编程能力备受关注。早期晶体结构显示，IMiDs结合CRBN的沙利度胺结合域（TBD）后，通常呈现Lon样结构域（LLD）与TBD紧密接触的"闭合"构象。然而，三个独立研究意外捕获到TBD与LLD分离的"开放"构象，引发对构象动态性的猜测。

冷冻电镜研究一举破解争议：通过统计构象分布发现，开放构象是药物结合但未招募底物的状态，而闭合构象才是底物识别的功能形态。更关键的是，不同IMiDs（如泊马度胺与美齐格度胺）可差异化调控开放-闭合平衡——美齐格度胺显著促进闭合构象，这与更高的底物泛素化效率直接相关。这种构象-功能关联性为设计更高效的分子胶药物提供了全新维度。

多亚基E3连接酶的构象全景："Rock-and-Roll"机制

SCF复合物的底物受体交换机制通过冷冻电镜捕获的47种中间态得以阐明。CAND1作为交换因子并非简单抑制CUL1，而是通过"摇摆-滚动"的精密协作完成SKP1-Fbox蛋白（Fbps）的置换：

1. 摇摆阶段：CAND1 C端先结合CUL1 C端，随后N端像机械臂般"摇摆"覆盖CUL1 N端，物理性破坏SKP1-Fbps结合界面
2. 滚动阶段：新SKP1-Fbps的入驻触发CAND1 N端解离，使复合体进入neddylation活化状态

这种动态交换使有限的CUL1支架能循环利用大量Fbps受体，显著扩展了SCF的底物谱。冷冻电镜不仅揭示了原子细节，更通过构象种群分析将离散的晶体结构整合为连续的功能图谱。

捕捉毫秒级事件：泛素链延伸的分子芭蕾

泛素链延伸的瞬态过程（毫秒级）通过化学交联策略被冷冻电镜"定格"。研究发现UBE2R2的16残基"协同环"像分子桥梁般同时连接E3、供体泛素和受体泛素，而C端延伸段则将催化中心精准导向底物。更颠覆的是，neddylation在链延伸阶段通过诱导CUL2 WHB结构域解离来增强E2-E3动态性——这与起始阶段nedd8稳定UBE2D结合的机制截然不同。

这些发现对PROTAC设计具有启示意义：当研究团队将体系拓展至CRL2^VHL-MZ1-PROTAC介导的BRD4降解时，发现类似的泛素转移机制，暗示天然与人工底物可能共享分子逻辑。

冷冻电镜的未来：从结构生物学到统计力学

前沿技术正在将冷冻电镜推向新维度：

• 统计结构生物学：机器学习算法解析构象连续体，量化药物对能量景观的扰动
• 毫秒级时间分辨：微流控混合技术与光笼底物有望捕捉泛素转移的过渡态
• 原位结构：冷冻电子断层扫描（cryo-ET）将揭示CRLs在细胞环境中的真实工作状态

这些进展将深化对E3调控机制的理解，为开发更精准的蛋白降解疗法铺平道路。从分子胶到PROTACs，冷冻电镜揭示的动态原理正成为药物设计的罗塞塔石碑。