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为解决萝卜细胞质雄性不育（CMS）分子机制不明的问题，研究人员以 NWB CMS 萝卜为对象，开展 ORF463a 相关研究。结果发现 ORF463a 与线粒体复合体 V 的 α 亚基（ATP1）互作，影响复合体 V 活性和 ATP 生成，导致花粉败育。该研究揭示了 NWB CMS 的分子机制。
在蔬菜种植领域，萝卜是一种经济价值颇高的全球性蔬菜，其杂交优势显著，利用细胞质雄性不育（CMS）系生产杂交种子是提升种子纯度的重要途径。目前已发现多种萝卜雄性不育细胞质类型，如 Ogura、Kosena、NWB 和 DCGMS 等。其中，Ogura CMS 虽在十字花科作物杂交育种中应用广泛，但存在一些局限性，比如部分萝卜品种缺乏维持其雄性不育的核基因，而且细胞质遗传单一性易使作物更易受特定病害侵袭。因此，寻找新的雄性不育细胞质源并探究其分子机制显得尤为重要。此前研究已将 orf463a 确定为与 NWB 细胞质雄性不育相关的候选基因，但该基因导致雄性不育的分子机制尚不明确。
为深入探究这一机制，北京蔬菜研究中心的研究人员开展了一系列研究。他们通过组织学分析、基因表达和蛋白表达模式分析，结合拟南芥（Arabidopsis）异位表达实验、蛋白互作研究以及转录组分析等方法，对 NWB CMS 萝卜进行了全面研究。相关研究成果发表在《Current Plant Biology》上，为萝卜雄性不育机制的解析提供了关键线索。
研究人员采用的主要关键技术方法如下：一是组织学分析，收集不同发育阶段的花芽，固定、脱水、包埋后切片染色观察花粉发育；二是基因表达分析，提取 RNA 进行逆转录和实时定量 PCR；三是蛋白相关实验，制备抗体进行蛋白质免疫印迹（western blotting），构建载体转化拟南芥观察表型，利用免疫共沉淀（CoIP）和酵母双杂交（Y2H）研究蛋白互作；四是转录组分析，构建 RNA 文库测序并进行生物信息学分析 。
下面来具体看看研究结果：
- ORF463a 积累与小孢子败育的关联：通过对 NWB CMS 和保持系花药进行切片观察，发现 NWB CMS 小孢子在单核小孢子期（S3）开始出现液泡化、形态不规则等异常，最终发育成畸形且无活力的花粉粒。同时，orf463a 基因表达和 ORF463a 蛋白积累在 S3 期达到最高，表明 ORF463a 积累与小孢子败育时期一致，高表达的 ORF463a 诱导萝卜 NWB 细胞质雄性不育。
- 拟南芥中 orf463a 表达导致雄性不育：构建两种过表达载体转化拟南芥，其中带有线粒体定位信号序列的 Vc463 载体转化的拟南芥，多数 T1 代转基因株系出现高比例异常果荚（短果荚且少籽），花粉活力低且不能正常萌发；而不含线粒体定位信号序列的 V463 载体转化的拟南芥，转基因株系异常果荚比例低。这表明 orf463a 在拟南芥中表达可导致雄性不育，且线粒体定位肽对其功能至关重要。
- ORF463a 与线粒体复合体 V 的 α 亚基（ATP1）互作：利用 IP-LC-MS/MS 分析筛选出与 ORF463a 互作的候选蛋白，聚焦于 ATP1。通过 CoIP 和 Y2H 实验验证了 ORF463a 与 ATP1 的互作，并确定 ORF463a 的 81 - 207aa 区域可与 ATP1 发生物理互作。
- ORF463a 影响复合体 V 活性和 ATP 含量：检测 NWB CMS 和保持系花芽中复合体 V 活性和 ATP 含量，发现 NWB CMS 系在花药发育过程中，复合体 V 活性和 ATP 含量显著降低，说明 ORF463a 与 ATP1 的互作影响了线粒体复合体 V 的活性，进而减少了 ATP 的生成。
- CMS 系中花粉发育相关基因表达改变：对 NWB CMS 和保持系花药进行转录组比较，共鉴定出 11208 个差异表达基因（DEGs）。KEGG 富集分析显示，差异表达基因主要富集在与次生代谢物生物合成、糖代谢和植物激素转导相关的途径。进一步分析发现，NWB CMS 系中许多与花粉发育直接相关的基因表达下调，尤其是在单核小孢子不对称有丝分裂、花粉壁形成、花药开裂和花粉释放等过程中。
综合研究结果和讨论部分，该研究明确了 ORF463a 在萝卜 NWB 细胞质雄性不育中的关键作用。ORF463a 在花药中的积累与小孢子败育相关，其与线粒体复合体 V 的 α 亚基（ATP1）互作，降低了复合体 V 的活性和 ATP 含量，干扰了能量代谢，进而影响了花粉发育相关基因的表达，最终导致花粉败育。此外，研究还发现 NWB CMS 与 Ogura CMS 在雄性不育表型和机制上存在差异，NWB CMS 的败育发生在较晚发育阶段，且可能受到环境和核背景的影响更大。该研究不仅揭示了 NWB CMS 的分子机制，还为萝卜及其他作物的雄性不育研究和杂交育种提供了重要的理论依据和实践指导，有助于推动相关领域的进一步发展 。
