CRISPR/Cas9 技术助力提升美国水稻品种赖氨酸含量，开启营养强化新篇章

为解决水稻赖氨酸含量低导致的营养问题，研究人员开展了利用 CRISPR/Cas9 系统敲除赖氨酸分解代谢途径中首个双功能基因的研究。结果获得多个赖氨酸含量显著提升且无不良农艺性状的转基因植株，为改善水稻营养价值奠定基础。

　　在全球粮食体系中，水稻是数十亿人的主食，为人们提供日常所需的大量热量。然而，水稻的营养价值却因其必需氨基酸含量不足而大打折扣。赖氨酸（Lys）作为人体和动物无法自身合成、必须从食物中获取的必需氨基酸，在水稻中的含量极低，成为限制水稻营养价值的关键因素。据统计，全球约 9.2% 的人口面临营养不良问题，其中蛋白质 - 能量营养不良（PEM）影响着 25 - 30% 的儿童，而赖氨酸摄入不足正是导致这些问题的重要原因之一。在以植物性饮食为主的地区，尤其是那些严重依赖水稻等主食作物的发展中国家，人们更容易出现赖氨酸缺乏的情况，进而引发儿童严重营养不良，影响其身体和智力发育。

为了攻克这一难题，来自国外的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们将目光聚焦于 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，旨在通过精准调控水稻基因，提高水稻籽粒中的赖氨酸含量。研究最终成功获得了多个转基因植株，这些植株的赖氨酸含量相比野生型有显著提升，且未对植株的形态和农艺性状产生负面影响，为改善水稻营养价值、解决营养不良问题带来了新的希望。该研究成果发表在《Current Plant Biology》杂志上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是基因编辑技术 CRISPR/Cas9，通过设计针对赖氨酸酮戊二酸还原酶 / 酵母氨酸脱氢酶（LKR/SDH）基因的单导向 RNA（sgRNAs），精准敲除目标基因。其次，利用液滴数字 PCR（ddPCR）技术检测转基因拷贝数，筛选出单拷贝转基因植株，便于后续获得无转基因的编辑植株。此外，借助 Sanger 测序和二代测序（NGS）技术对突变模式进行分析和验证。

下面来详细了解一下研究结果。

1. 体外 RNP 消化验证与植物转化：研究人员最初针对 LKR/SDH 基因设计 sgRNAs，后发现靶点位于外显子 14 且有重叠。体外 RNP 实验表明，Cas9 蛋白与特定 sgRNAs 共同作用时可有效切割目标 DNA，验证了靶点的有效性。随后，将含有 sgRNAs 的载体通过农杆菌介导转化法导入水稻品种 Presidio 的愈伤组织，成功获得转基因植株。
2. 确定水稻转基因拷贝数：运用 ddPCR 技术对 20 个 T₀转基因事件进行分析，结果显示 10 个事件含有单拷贝的 hptII 转基因，7 个有两个拷贝，3 个有三个拷贝。这一结果为筛选合适的转基因植株提供了重要依据。
3. T₀转基因水稻植株的靶向诱变：通过 PCR 筛选确认 20 株 T₀植株均为阳性，表明 T - DNA 成功整合到基因组中。进一步的测序分析发现，19 株 T₀植株发生了 CRISPR 编辑，突变类型包括缺失、插入和碱基替换，其中双等位基因杂合突变最为常见，其次是双等位基因纯合突变。这些突变大多导致移码突变，使基因功能丧失。最终，根据突变类型和转基因拷贝数，选取 4 个事件进入下一代研究。
4. 检测 T₁植株中的无转基因株系和突变模式：对 T₀代选定植株的 T₁代 progeny 进行分析，通过 PCR 筛选确定了 14 株无转基因植株。对这些植株的突变模式分析发现，突变模式的分离符合孟德尔遗传比例（1:2:1），且 14 株中有 7 株表现出纯合编辑。同时，T₁代植株的农艺性状与野生型相比无显著差异。
5. 筛选 T₂代验证 T₁代结果：对 T₁代的 14 株无转基因植株的 T₂代 progeny 进行验证，结果表明这些植株均为无转基因且 LKR/SDH 基因纯合编辑。对两个赖氨酸含量最高的株系进行农艺性状分析，发现与野生型相比无显著差异。
6. 测量 LKR/SDH 编辑的 T₂和 T₃种子中的赖氨酸含量：对 T₂代 7 个无转基因株系的种子进行赖氨酸含量分析，发现部分株系的赖氨酸含量相比野生型有显著提升，最高可达 1.91 倍。对 T₃代种子的分析进一步证实，赖氨酸含量的增加是稳定且可遗传的，两个株系的 T₃代种子赖氨酸含量较野生型有 1.4 - 1.6 倍的提升。

综合研究结果和讨论部分，该研究具有多方面的重要意义。从技术层面来看，研究验证了重叠 sgRNAs 在 CRISPR/Cas9 系统中的有效性，为基因编辑技术的应用提供了新的思路。同时，研究中使用的多种检测和筛选技术，如 ddPCR、Sanger 测序和 NGS 等，为精准鉴定转基因植株和突变模式提供了可靠的方法。从营养改善角度，通过 CRISPR/Cas9 敲除 LKR/SDH 基因，成功提高了水稻籽粒中的赖氨酸含量，且未对农艺性状产生负面影响，这为培育营养强化型水稻品种提供了可行的方案。此外，与传统转基因方法相比，CRISPR 编辑的作物在监管方面更具优势，更易被公众接受，有助于推动营养强化作物的商业化进程。该研究为解决全球营养不良问题、提高粮食营养价值开辟了新途径，也为未来在其他作物中的研究和应用奠定了坚实基础。