编辑推荐：
辣椒再生和转基因体系发展滞后，限制了其基因工程研究。研究人员以辣椒为对象，探究其再生机制。发现 CaRcd1 正调控辣椒再生，通过与 CaGATA26 互作抑制 CaTMKL1 表达。该成果为植物组织培养提供新思路。
辣椒，这种在餐桌和工业领域都占据重要地位的作物，富含生物活性化合物，在制药、化妆品等行业有着广阔的应用前景。随着分子生物学的发展，辣椒育种借助分子标记和基因组学取得了显著进展，但转基因和基因编辑技术的应用却因缺乏高效的遗传转化系统而受阻。
植物再生是建立遗传转化系统的关键步骤，通常采用植物细胞和组织培养技术。在这个过程中，植物激素起着核心作用，影响着细胞的脱分化和再分化。然而，辣椒的再生和转基因进程远远落后于其他茄科植物，其高度依赖基因型且再生困难。在辣椒的组织培养中，常常出现莲座状或发育不良的叶状芽，难以正常伸长，而且植物细胞、组织和器官对体外培养条件响应不佳。尽管研究人员不断探索，尝试通过调整培养基中激素的种类和浓度、引入特定基因等方法来提高辣椒的再生能力，但再生效率低和稳定遗传转化困难的问题依然存在。
为了解决这些难题，中国农业大学的研究人员开展了一项深入的研究。他们致力于揭示辣椒再生的分子机制，寻找关键调控因子，为辣椒的遗传转化和品种改良提供理论依据和技术支持 。最终，研究人员发现了 CaRcd1（Required for cell differentiation 1）在辣椒再生过程中起着至关重要的正调控作用，这一发现为解决辣椒再生难题带来了新的曙光，相关研究成果发表在《Current Plant Biology》上。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，对 60 个辣椒品种进行再生能力评估，筛选出高再生能力的品种 R60 。接着，通过 RNA 测序（RNA-seq）分析不同再生阶段的基因表达差异，鉴定出与再生能力相关的基因。然后，利用农杆菌介导的转基因技术，对关键基因进行过表达验证。此外，采用酵母杂交实验、双荧光素酶报告基因实验（Dual-LUC）、免疫沉淀 - 质谱（IP-MS）等技术，研究蛋白质之间的相互作用及对基因表达的调控机制。
研究结果
- 筛选高再生能力品种并优化再生体系：研究人员评估了 60 个辣椒品种的再生能力，发现 R60 具有最强的再生潜力。通过调整培养基中激素的种类和比例，确定了 R60 胚胎愈伤组织诱导、芽诱导、芽伸长和生根的最佳培养基配方。利用优化后的方法，R60 再生植株的获得效率显著提高，正常芽分化率达到 31.4%，生根率达到 75.5% 。同时，建立了基于 R60 的高效、可重复和稳定的遗传转化系统，正常芽分化率为 5.8%，共培养时添加半胱氨酸可将转化效率提高到 1.3%。
- 鉴定与再生能力相关的基因：通过 RNA-seq 分析不同分化阶段的基因表达差异，研究人员发现了 348 个在正常脱分化（NorDe）与过度脱分化（ExDe）、未脱分化（NonDe）与过度脱分化比较中均存在的差异表达基因（DEGs）。在异常分化（AbDi）和正常分化（NorDi）的比较中，发现了 4743 个 DEGs，其中与再生能力相关的基因包括编码赤霉素受体的 CA02g00610、与生长素响应因子相关的基因等。进一步聚焦于同一品种内 AbDi（R60）和 NorDi（R60）的差异，鉴定出 9 个 DEGs，其中 CaRcd1、CaACOT13、CaPES1 在 NorDi（R60）中上调，CaTMKL1 下调。
- 关键基因的功能验证：对 CaRcd1、CaACOT13、CaTMKL1、CaPES1 进行过表达实验，结果表明，CaRcd1 过表达（CaRcd1 - OE）可使正常芽分化率提高到 13.0%，显著高于对照组和之前转基因系统开发中的数据，说明 CaRcd1 是调控辣椒芽分化的重要候选基因。CaPES1 过表达导致外植体漂白且无法分化；CaTMKL1 过表达使外植体不能正常分化；CaACOT13 过表达的外植体正常分化率略高于对照组，并出现早熟生根现象。
- 揭示 CaRcd1 的调控机制：通过 IP-MS 筛选出与 CaRcd1 相互作用的转录因子 CaGATA26，酵母双杂交实验（Y2H）进一步证实了二者的相互作用。CaGATA26 可与生长素相关基因 CaTMKL1 的启动子结合，促进其表达。而 CaRcd1 与 CaGATA26 结合后，会削弱 CaGATA26 与 CaTMKL1 启动子的结合能力，抑制 CaTMKL1 的表达。分子对接和等温滴定量热法（ITC）实验表明，CaTMKL1 是一种生长素结合蛋白，CaRcd1 通过抑制 CaGATA26 对 CaTMKL1 的促进作用，减少生长素的结合，从而促进辣椒正常芽的分化。
研究结论与讨论
本研究首次揭示了 CaRcd1 通过与 CaGATA26 相互作用，抑制 CaTMKL1 表达，从而正调控辣椒再生的新机制。这一发现为解决辣椒再生难题提供了新的理论依据和潜在的技术手段，有助于推动辣椒遗传转化和基因编辑技术的发展，加速辣椒品种改良进程。同时，考虑到 Rcd1 结构域在高等植物中的高度保守性，CaRcd1 在其他再生困难的植物物种中可能也具有相似的功能，为植物组织培养技术的发展提供了新的思路和方向 。
尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，该调控机制在不同辣椒品种以及其他植物物种中的普遍性还需要进一步验证；CaRcd1 参与的具体信号通路和调控网络仍有待深入研究。未来的研究可以针对这些问题展开，进一步完善对植物再生调控机制的理解，为植物生物技术的发展提供更坚实的理论基础。
