综述：基于家蚕BmN4细胞研究整合不同piRNA生物合成通路的模型

这篇综述系统梳理了家蚕BmN4细胞中piRNA（PIWI-interacting RNA）生物合成的三大通路：初级（线粒体膜依赖的ZUC切割）、次级（AGO3介导的"乒乓"循环扩增）和三级（ZUC触发的"拖尾"成熟），提出首个整合性模型，揭示非膜性细胞器（如nuage）在空间分隔反应中的关键作用，为解析昆虫转座子沉默机制和病毒衍生piRNA（vpiRNA）形成提供新框架。

　　

1. 引言

在真核生物基因表达调控网络中，PIWI相互作用RNA（piRNA）作为一类24-32nt的小RNA，通过沉默转座子（TEs）维持生殖细胞基因组稳定性。家蚕（Bombyx mori）BmN4细胞系因其完备的piRNA系统成为研究典范，该细胞表达两个PIWI家族蛋白——SIWI和AGO3，其生物合成机制比经典模式生物果蝇更为复杂。近年研究发现，piRNA通路不仅参与TE沉默，还通过切割靶标转录本或表观修饰调控内源基因，并在多种昆虫中呈现跨组织表达特征。

2. piRNA生物合成通路

2.1 初级SIWI-piRISC合成

piRNA簇转录产生的单链前体（pre-piRNA）被转运至线粒体外膜，由锚定于此的磷脂酶D超家族内切酶Zucchini（ZUC）切割形成中间体（int-piRNA）。精氨酸甲基转移酶CAP催化SIWI蛋白N端对称二甲基化（sDMA），使其通过Tudor结构域与线粒体定位的PAPI蛋白结合。在Par-1激酶磷酸化PAPI后，int-piRNA的5'端被装载入SIWI，3'端则与PAPI的KH结构域结合。随后ZUC二次切割触发HEN1介导的3'端2'-O-甲基化，最终由CAF1家族核酸酶TRIM修剪至~28nt成熟长度。值得注意的是，初级piRNA可能缺乏显著的5'端碱基偏好性，这与病毒衍生piRNA（vpiRNA）的弱1U偏倚现象一致。

2.2 次级AGO3-piRISC合成

当转座子激活时，细胞质中的SIWI-piRISC切割其转录本形成int-piRNA，并与Vasa、BmYb、ARMI等蛋白形成复合物迁移至线粒体膜。在ATP依赖过程中，Vasa将int-piRNA从SIWI转移至PAPI结合的AGO3。根据int-piRNA长度差异，成熟过程分为两种路径：短片段（type N）直接由TRIM修剪；长片段（type E）需先经ZUC切割再甲基化。成熟后的AGO3-piRISC（27nt）随后进入核周非膜性细胞器nuage，形成以VRET蛋白为支架的AGO3小体。

2.3 次级SIWI-piRISC合成

在nuage中，AGO3-piRISC切割piRNA簇转录本产生新的int-piRNA，通过VRET二聚体招募未装载的SIWI形成"MAEL小体"。Spn-E解旋酶以ATP依赖方式将int-piRNA转移至SIWI，随后HSP90/SHU复合物回收AGO3。该过程产生的"响应者"piRNA与初级piRNA序列相同，但通过ZUC切割位点的-10A/-2A/+4C共识模体强化了1U偏倚特征。

2.4 三级拖尾通路

ZUC切割type E int-piRNA时，除定义响应者piRNA的3'端外，还同步决定下游"拖尾"piRNA的5'端，形成具有强烈1U偏倚的新生piRNA。这种"寸进"式加工在果蝇中依赖ARMI介导的线粒体定位，但在家蚕中是否需PAPI参与尚待验证。

3. 非膜性细胞器的核心作用

Vasa小体、AGO3小体和MAEL小体等通过液-液相分离（LLPS）形成的无膜区室，为piRNA合成提供空间分隔的反应中心。这些富含内在无序区域（IDR）蛋白（如SIWI、MAEL）的凝聚体，既能防止非特异RNA加工，又通过浓缩通路组分提升转座子沉默效率。线粒体表面由Gasz-GPAT1复合物搭建的锚定平台，则成为ZUC催化的分子反应台。

4. 结论展望

该整合模型揭示：初级通路产生无偏倚的piRNA初始库；次级"乒乓"循环产生10nt间隔的互补piRNA对；三级拖尾通路放大1U偏倚信号。未来需解析pre-piRNA的定向输送机制、MAEL在拖尾通路的具体功能，以及PAPI在三级合成中的作用。该框架为解读昆虫转座子沉默、病毒piRNA形成及跨代表观遗传提供重要工具。