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非酒精性脂肪肝（NAFLD）全球高发且无特效治疗药物。研究人员开发基于细胞的 96 孔板检测法筛选抑制脂质积累的潜在药物。该方法用 CCK8 测细胞毒性、BODIPY 493/503 测脂质含量，结果可靠，为 NAFLD 治疗药物研发提供新途径。
非酒精性脂肪肝（NAFLD）如今已成为全球慢性肝病的常见病因之一，其发病率随着全球肥胖症的流行而不断攀升。据估算，到 2040 年，全球约 50% 的成年人可能会患上 NAFLD。NAFLD 不仅会引发肝脏问题，还与多种肝外并发症密切相关，如 2 型糖尿病（T2DM）、高血压（HTN）和心血管疾病（CVD）等，给社会和经济带来了沉重负担。然而，目前针对 NAFLD 的治疗手段极为有限，既没有特定的手术干预方法，也缺乏被批准的治疗药物。而且，许多现有药物还可能诱导脂肪变性，干扰临床试验或导致药物撤市。在这样的背景下，开发一种高效、可靠的筛选抑制脂质积累药物的方法迫在眉睫。
为了解决这一难题，研究人员开展了一项极具意义的研究。他们开发了一种基于细胞的 96 孔板检测方法，旨在筛选出能够抑制脂质积累的潜在药物。这项研究成果发表在《Current Research in Toxicology》上，为 NAFLD 的治疗药物研发带来了新的希望。
研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，培养了人肝癌细胞系 Huh7、HepG2，小鼠肝癌细胞系 Hepa1-6 以及正常小鼠肝细胞系 AML12。接着，使用细胞计数试剂盒 - 8（CCK8）检测细胞毒性，通过荧光检测法，利用脂质滴特异性荧光染料 BODIPY 493/503 检测脂质含量，并使用 4′,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）染色校准细胞数量。此外，还用荧光显微镜观察作为对照。
下面来详细看看研究结果：
- 确定最佳浓度：研究人员首先确定了 BODIPY 493/503 和 DAPI 的最佳工作浓度。通过实验发现，2μM 的 BODIPY 493/503 和 5μg/ml 的 DAPI 在保证足够荧光强度的同时，能有效避免背景干扰，因此在后续实验中选择了这两个浓度。
- 评估影响因素：研究发现细胞固定对 BODIPY 493/503 染色在荧光检测法中是必要的，未固定的细胞在检测时脂质滴含量不会随脂肪酸（FFAs）浓度增加而增加。同时，CCK8 检测不会干扰后续 BODIPY 493/503 对脂质滴的相对定量，这使得在同一 96 孔板中先检测细胞毒性再检测脂质沉积成为可能。
- 对比检测方法：将荧光检测法与荧光显微镜检测法进行对比，结果显示两种方法在定量脂质滴方面具有可比性，但荧光检测法的组内变异性更低，精度更高。例如，在检测 FFAs 处理组与对照组的脂质滴含量时，荧光检测法的平均增加倍数为 1.65 倍（SD = 0.063，CV = 3.83%），而荧光显微镜检测法的平均增加倍数为 1.66 倍（SD = 0.17，CV = 10.42%）。
- 确定 FFAs 浓度：研究人员对不同浓度的 FFAs 进行测试，以确定适合药物筛选的浓度。结果表明，0.042O/0.021P 的 FFAs 浓度对 Huh7 和 HepG2 细胞无明显毒性，且能促进脂质沉积，因此在评估药物诱导的脂肪变性时，选择该浓度进行预处理；0.1O/0.05P 的 FFAs 浓度虽有一定细胞毒性，但能诱导足够的脂质积累，可用于评估药物对脂质沉积的影响，后续选择 Huh7 细胞进行验证实验。
- 验证检测方法：研究人员使用 10 种已知的脂肪变性诱导剂、5 种阴性对照以及 ML261（一种已知的肝脂质滴形成抑制剂）对新建立的荧光检测法进行验证。结果显示，该方法能准确识别 15 种测试药物对脂质滴含量和细胞毒性的影响，且能有效检测出 ML261 对脂质积累的抑制作用。例如，10 种阳性药物在选定的工作浓度范围内均表现出不同程度的细胞毒性和剂量依赖性的脂质滴含量增加；5 种阴性药物对脂质滴含量无显著影响；ML261 在 AML12 细胞和 Hepa1-6 细胞中均能剂量依赖性地降低脂质滴含量。
研究结论和讨论部分表明，该研究成功建立了一种简单、可靠的筛选潜在脂肪肝抑制剂的方法。这种方法无需昂贵仪器，操作简便，能够在药物开发的早期阶段快速、高效地评估药物的细胞毒性和对脂质沉积的影响。虽然它不能提供全面的肝脏毒性参数，但对于识别 NAFLD 治疗的候选药物具有重要价值。而且，该方法采用 96 孔板格式，具有高通量筛选的潜力，有望进一步扩展到 384 孔或 1536 孔板，还可用于除肝细胞外的其他细胞的脂质定量。这一研究成果为 NAFLD 治疗药物的研发开辟了新的道路，为攻克这一全球性的健康难题带来了新的曙光。
