精准锚定：探寻 BALB/c 小鼠受 TCDD 暴露后组织特异性稳定内参基因

在研究 2,3,7,8 - 四氯二苯并对二噁英（TCDD）毒性时，传统看家基因（HKGs）稳定性欠佳影响基因表达分析准确性。研究人员通过数据库筛选等步骤，确定 15 个 HKGs 并评估其稳定性。结果找到各组织稳定 HKGs，为 TCDD 毒性研究提供可靠参考。

　　在环境污染物的大家族里，二噁英是极为 “臭名昭著” 的一员。国际癌症研究机构已将其列为 “人类致癌物”，其中 2,3,7,8 - 四氯二苯并对二噁英（TCDD）毒性最强，在成人身体里的半衰期长达 3 - 9 年。TCDD 会对哺乳动物的肝脏、肾脏、肺以及生殖系统等造成严重损害，它主要通过与芳香烃受体（AhR）结合发挥毒性作用。由于不同组织的脂质含量和 AhR 表达水平不同，TCDD 在不同组织中的毒性表现也大相径庭，会引发发育毒性、代谢毒性、生殖毒性等多种不良效应。

在研究 TCDD 毒性的过程中，准确检测基因表达水平至关重要。逆转录定量聚合酶链反应（RT - qPCR）因操作简便、灵敏度高、精确可靠，成为评估特定基因表达水平的常用方法。然而，该方法的准确性高度依赖内源性 “参考” 基因，也就是看家基因（HKGs）的选择。传统常用的 HKGs，如 β - 肌动蛋白（Actb）、甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（Gapdh）和核糖体 Rn18S，在不同组织和实验条件下，mRNA 丰度并不稳定。使用不稳定的 HKGs 进行 qPCR 归一化，会导致基因表达定量不准确，出现错误解读和不可重复的结果。比如，在炎症研究中常用的 Gapdh，在免疫反应中会上调，可能掩盖细胞因子基因（如 IL - 6、TNF - α）的上调；Actb 在癌症组织中表达变化大，不适合用于癌基因（如乳腺癌中的 HER2）表达的归一化；18S rRNA（Rn18S）在药物反应研究中会受药物治疗影响，导致对基因表达变化的错误解读。由此可见，选择合适的稳定 HKGs 对准确研究 TCDD 毒性至关重要，但此前这方面的研究还是空白。

为了解决这一难题，来自国外的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们以急性暴露于 TCDD 的 BALB/c 小鼠为研究对象，旨在筛选出适用于不同组织基因表达分析的稳定 HKGs。该研究成果发表在《Current Research in Toxicology》上。

研究人员采用了一系列关键技术方法：首先，通过在 PubMed 数据库检索相关文献，并利用在线转录组工具 Housekeeping and Reference Transcript Atlas（HRT Atlas），筛选出 40 个潜在的 HKGs；然后，从文献、HRT Atlas 数据库获取引物或自行设计引物，并对引物的效率和特异性进行验证；接着，选取 24 只 12 周龄的 BALB/c 小鼠，分为实验组和对照组，实验组给予 25 μg TCDD/kg 的剂量，对照组给予等量玉米油，7 天后处死小鼠并采集肝脏、肾脏、肺、卵巢和睾丸组织；之后，提取组织 RNA 并合成 cDNA，利用 RT - qPCR 检测候选 HKGs 的表达；最后，运用 RefFinder 算法，结合 BestKeeper、NormFinder、geNorm 等程序以及比较 ΔCt 法，对候选 HKGs 的稳定性进行评估。

下面来看具体的研究结果：

• 候选看家基因的筛选：通过文献和数据库筛选出 40 个 HKGs，其中 23 个来自先前研究，17 个来自 HRT Atlas 数据库。根据使用频率和表达稳定性对这些基因进行排序，最终确定 20 个潜在 HKGs 进入后续实验。
• 引物的设置和验证：对 20 对引物在对照小鼠肝脏组织的 cDNA 中进行测试，根据 PCR 效率和特异性，排除了 6 个基因，最终确定 15 个具有合适扩增效率的 HKGs（Rps18、Calr、Polr2b、Brms1l、P4hb、Esd、Hdgf、Gapdh、Mlec、Tbp、Rn18s、Sdha、B2m、Actr3 和 Actb）进入下一步研究。这些基因的扩增效率在 90% - 100% 之间，且组内和组间变异系数较低，保证了实验的准确性和可重复性。
• 不同组织中 HKGs 的稳定性分析：
  • 肝脏：研究发现，在 TCDD 暴露下，肝脏中 [log (2^ΔCt)] 值显示，Rps18、Polr2b、Gapdh、Mlec、Rn18s、Sdha 和 Actb 的表达变化较小。经 BestKeeper 算法分析，Actb、Rps18、Polr2b、Gapdh 和 Sdha 在表达稳定性方面排名前五，表明它们是 TCDD 诱导的小鼠肝毒性研究中稳定的 HKGs，可用于靶基因表达的归一化。
  • 肾脏：在肾脏组织中，Sdha、Actb、Gapdh、B2m 和 Rn18s 的 [log (2^ΔCt)] 值最接近零，表达稳定性最佳。BestKeeper 算法排名也显示，这五个基因在稳定性方面位居前列，因此 Sdha、Actb 和 Gapdh 适合作为 TCDD 诱导的小鼠肾脏毒性研究中的稳定 HKGs。
  • 肺：在小鼠肺组织中，Tbp、Sdha、Rps18、B2m 和 Rn18s 的 [log (2^ΔCt)] 值接近零，稳定性较高。BestKeeper 算法分析表明，它们在稳定性排名中处于前五位，可作为 TCDD 诱导的小鼠肺毒性研究中稳定的 HKGs 用于基因表达归一化。
  • 卵巢：对于卵巢组织，Tbp、B2m、Actb、Rn18s 和 Gapdh 的 [log (2^ΔCt)] 值接近零，表达稳定。BestKeeper 算法排名显示它们稳定性靠前，其中 Tbp、B2m 和 Actb 可作为 TCDD 诱导的小鼠雌性生殖毒性研究中稳定的 HKGs。
  • 睾丸：在睾丸组织中，Actb、B2m、Tbp、Gapdh 和 Rp18s 的 [log (2^ΔCt)] 值接近零，稳定性良好。BestKeeper 算法排名显示它们在稳定性方面位居前列，Actb、B2m 和 Tbp 可作为 TCDD 诱导的小鼠雄性生殖毒性研究中稳定的 HKGs。
  
  
• 综合排名：研究人员使用 BestKeeper、NormFinder 和 GeNorm 算法对各组织中排名前五的 HKGs 进行综合评估，发现 B2m、Gapdh 和 Actb 在所有研究组织中始终位列最稳定基因的前三名，表明它们适用于 TCDD 暴露小鼠多种器官基因表达归一化的参考基因。研究还建议，在未来涉及 TCDD 暴露小鼠组织的基因表达研究中，至少使用 Gapdh 和 Actb 这两个基因进行可靠的归一化。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功制定了基于公开转录组数据集选择合适 HKGs 的策略，并设计和验证了 RT - qPCR 检测方法。通过该策略筛选出的稳定 HKGs 在 TCDD 毒性研究中表现优于传统常用的归一化基因。研究发现不同组织中稳定的 HKGs 存在差异，且多个稳定 HKGs 组合（如 Gapdh 和 Actb）能更准确地进行基因表达归一化。这一研究为 TCDD 毒性研究中组织特异性基因表达分析提供了可靠的 HKGs 选择依据，有助于提高研究的准确性和可靠性，推动 TCDD 毒性相关领域的研究进展。