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这篇综述聚焦人多能干细胞（hPSCs）衍生细胞治疗产品（CTPs）的安全性，详细探讨其致瘤风险，重点评估残留未分化 hPSCs 引发畸胎瘤的风险。对比体内外检测方法，发现体外检测如数字 PCR（dPCR）和高效培养（HEC）检测灵敏度更高，为产品质量控制提供参考。
引言
自胚胎干细胞（ESCs）发现 40 多年来，再生医学发展迅速，多能干细胞（PSCs）的出现进一步丰富了细胞治疗手段。截至 2024 年底，全球人类多能干细胞（hPSCs）相关临床试验已达 115 项，其中人类诱导多能干细胞（hiPSC）相关试验约占 60%。然而，hPSCs 衍生产品尚未获批商业化，其面临的主要安全问题包括产品中可能存在残留未分化的多能干细胞，具有体内形成畸胎瘤的高风险，以及基因组不稳定 / 致瘤性等。
为解决这些问题，健康与环境科学研究所（HESI）于 2015 年底成立了细胞治疗 - 追踪、循环与安全（CT - TRACS）委员会，致力于评估细胞治疗产品的安全性和命运。该委员会发布了相关立场文件，并开展了多项多中心研究，对体外检测方法进行评估。本文旨在全面综述 hPSCs 衍生 CTPs 的致瘤风险，重点关注残留未分化 hPSCs，并评估现有体外检测方法，为评估 hPSCs 衍生 CTPs 的致瘤风险提供策略指导。
多能干细胞衍生细胞治疗产品的致瘤风险概述
hPSCs 衍生 CTPs 的致瘤风险包括多个方面，如残留 hPSCs、意外细胞转化、基因组不稳定、潜在致瘤性以及患者自身易患肿瘤的背景等。针对这些风险，相应的缓解策略包括纯化最终产品、监测细胞制造过程、确保原材料质量控制、长期随访患者以及评估患者个体肿瘤形成倾向等。
目前有多种体外检测方法可用于评估基因组完整性或细胞转化，如新一代测序（NGS）、染色体核型分析、荧光原位杂交等。然而，这些检测方法在全球范围内尚未完全标准化，HESI CT - TRACS 委员会正在开展多项国际多中心研究，以评估和改进这些方法的稳健性。
评估残留的多能干细胞
残留多能干细胞的分类
在 hPSCs 衍生 CTPs 中，残留未分化 hPSCs 常被称为 “杂质”“污染物” 或 “残留细胞”。从监管角度看，根据国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q6B 指南以及欧洲和加拿大的相关规定，未分化 hPSCs 更准确地应被定义为 “产品相关杂质”。由于其具有高畸胎瘤形成潜力，在最终产品中的存在应受到限制，并设定尽可能敏感的验收标准。
体内检测残留多能干细胞的方法
监管机构通常要求在 hPSCs 衍生 CTPs 进入临床试验前进行非临床体内致瘤性研究，观察期一般涵盖动物的整个生命周期或直至产品从动物体内消除。然而，这种体内研究的可转化性存在争议。
畸胎瘤形成试验是评估 hPSCs 多能性的 “金标准”，但该试验成本高、耗时长且需要专业技术。常用的动物模型包括裸鼠、严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠等，不同动物模型的免疫缺陷程度不同，移植成功率也有所差异。细胞解离方法、注射部位等因素都会影响畸胎瘤形成的可能性。例如，单细胞解离的 hPSCs 需要更高的细胞数量才能形成畸胎瘤，而添加细胞外基质或饲养细胞可提高其植入率；注射部位方面，肾脏囊注射的畸胎瘤发生率最高，皮下注射次之。
通过分析不同注射部位形成畸胎瘤所需的 hPSCs 数量，可以评估体内检测的灵敏度。在最敏感的模型中，体内检测的灵敏度估计为 0.0002 - 0.001%，但当使用临床等效的移植部位且不添加辅助物质时，灵敏度会进一步降低。
体外检测残留多能干细胞的方法
由于体内畸胎瘤检测方法存在灵敏度不足等问题，且为遵循动物实验的 3R 原则（替代、减少、优化），越来越多的体外检测方法被开发出来。这些体外检测方法主要基于检测 hPSCs 特异性表达的 RNA、表面蛋白或在选择性培养条件下检测残留 hPSCs。
- 检测 hPSC 特异性 RNA：基于分化细胞和未分化细胞基因表达的差异，通过提取 RNA 并进行 PCR 检测来识别残留 hPSCs。常用的标记基因如 LIN28A，此外还有 ESRG、LINC00678 等多种基因被用于不同细胞类型中残留 hPSCs 的检测。定量 PCR（qPCR）和数字 PCR（dPCR）是常用的检测方法，dPCR 在检测少量 mRNA 时比 qPCR 更稳健、灵敏，且能提供绝对值，无需标准曲线。逆转录环介导等温扩增（RT - LAMP）也可用于检测残留 hPSCs，其受干扰物质影响较小，能检测到低至 0.00002% 的 hiPSCs。
- 检测 hPSC 特异性表面标记：通过检测 hPSCs 表面蛋白和其他结构来识别残留 hPSCs。流式细胞术可用于检测，但灵敏度较低，主要适用于研究目的。表面增强拉曼散射（SERS）灵敏度较高，能检测到 0.0001% 的 hiPSCs，但仍依赖单细胞悬浮液。通过检测细胞裂解物中的糖鞘脂聚糖来识别残留 hPSCs 的方法，虽然细胞输入量要求低，但灵敏度相对其他体外方法较低。
- 检测细胞培养基中的 hPSC 特异性成分：为避免对细胞材料的破坏或标记，开发了非侵入性方法检测 hPSCs 释放到培养基中的特定成分。例如，通过检测培养基中分泌的 podocalyxin 或特定的 miRNA 来识别残留 hPSCs，但这些方法的检测限受培养基成分和细胞培养条件影响。
- 高效培养系统检测未分化 hPSCs：高效培养（HEC）检测通过在特定条件下培养 CTP，促进未分化 hPSCs 扩增，然后对形成的菌落进行染色和计数。多项多中心研究表明，HEC 检测的稳健性和灵敏度与基于 PCR 的方法相当，且不依赖特定标记，但检测耗时较长。
HESI CT - TRACS 的多中心研究：迈向全球协调
HESI CT - TRACS 委员会开展了多项国际多中心研究，评估体外检测残留未分化 hPSCs 的方法，其中 dPCR 和 HEC 检测已扩展为多中心研究，有望成为体外致瘤性检测的标准方法。
在 dPCR 检测的多中心研究中，通过两步两臂方法评估检测的变异性。第一步评估 dPCR 本身的变异性，第二步评估整个过程的变异性。研究发现，实验室间变异性的主要来源是 hiPSC 加样过程，而非 dPCR 分析本身。
HEC 检测的多中心研究在四个不同地点进行，将 0.0005% 或 0.0015% 的 hiPSCs 加入人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iCMs）中，培养 7 天后计数碱性磷酸酶（ALP）染色的菌落数。结果显示，该检测方法灵敏度高、重复性和再现性良好，加样过程是实验室间变异性的主要来源。
讨论
体内畸胎瘤检测方法的灵敏度受多种因素影响，在模拟临床配方和移植部位时灵敏度降低。而体外检测方法如 dPCR 和 HEC 检测更敏感，HESI CT - TRACS 的多中心研究表明，这两种方法稳健且灵敏，可作为体内检测的替代方法。
监管指南通常要求进行体内致瘤性研究评估 hPSCs 衍生 CTPs 的畸胎瘤形成风险，但也鼓励使用体外和 / 或体外方法作为补充。当有经过验证的高灵敏度体外检测方法时，HESI CT - TRACS 建议用体外检测替代体内检测。
在选择体外检测方法时，应针对每种产品进行加标实验评估检测效率，确保检测限与体内检测相当或更低。不同体外检测方法各有优缺点，应根据产品特点选择合适的检测方法。例如，基于标记的检测方法中，LIN28A 虽常用，但在某些细胞类型中不适用，需根据细胞类型选择和验证合适的标记基因；HEC 检测虽可直接检测未分化 hPSCs，但不适用于某些会影响未分化 hPSCs 存活的产品。
此外，除残留未分化 hPSCs 外，其他因素如原癌基因 / 抑癌基因突变、染色体异常等也会影响 hPSCs 衍生 CTPs 的致瘤性。体内研究在检测某些遗传改变导致的转化风险时存在局限性，而体外转化检测方法可识别这些风险。HESI CT - TRACS 正在开展相关研究，以改进或开发体外检测方法，从遗传改变和转化的角度降低 hPSCs 衍生 CTPs 的致瘤风险。
结论
残留未分化 hPSCs 应被视为最终产品中的杂质，因其具有致畸和致瘤潜力，应在 hPSCs 衍生 CTPs 中尽量减少其存在。评估残留未分化 hPSCs 应纳入药品质量控制过程。目前的体外检测方法如 dPCR 和 HEC 检测稳健且比传统体内检测更敏感，在应用前应通过加标实验仔细评估其对每种产品的灵敏度。当有经过验证的高灵敏度体外检测方法时，建议用体外检测替代体内检测，以评估 hPSCs 衍生 CTPs 的潜在致瘤风险。
