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柑橘黑斑病（CBS）由Phyllosticta citricarpa引起，欧盟将其列为检疫性有害生物。与之相关的Phyllosticta citriasiana易混淆。研究人员开发实时荧光定量 PCR 检测方法，发现二者宿主存在特异性。这有助于优化检测，保障柑橘产业健康发展。
在柑橘的世界里，一场看不见的 “战争” 正在悄然上演。柑橘黑斑病（Citrus black spot，CBS）如同一个可怕的 “侵略者”，严重威胁着柑橘的健康生长。它由
Phyllosticta citricarpa真菌引发，一旦 “入侵” 柑橘果园，会让柑橘果实布满病斑，造成果实提前掉落，给柑橘产业带来巨大的经济损失。欧盟深知其危害，将
Phyllosticta citricarpa列为严格管控的检疫性有害生物，对进口柑橘实施严格的检验检疫措施。
然而，在与 CBS 的 “战斗” 中，研究人员发现情况变得越来越复杂。原来，柑橘上还存在着一些与Phyllosticta citricarpa极为相似的Phyllosticta属真菌，比如Phyllosticta citriasiana。它能引发柑橘褐斑病（Citrus tan spot，CTS），虽然在欧盟未被列为检疫对象，但它的存在却给 CBS 的诊断带来了极大的干扰。过去，在对柑橘果实进行检测时，常常会因为难以区分这两种真菌，导致诊断失误。比如，曾经将Phyllosticta citriasiana引发的症状误判为 CBS，给检疫工作和柑橘产业带来了不必要的麻烦和损失。
为了攻克这些难题，来自荷兰国家植物保护组织（Netherlands Institute vor Vectors, Invasive Plants and Plant Health，NIVIP）、荷兰食品和消费品安全局（Netherlands Food and Consumer Product Safety Authority，NVWA）的研究人员 Marcel M. J. P. van Raak、Esther J. van Veen 等人，展开了一场深入的研究。他们的研究成果发表在《European Journal of Plant Pathology》上，为柑橘病害的诊断和防控带来了新的曙光。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是 DNA 提取技术，从单个病斑或真菌培养物中提取 DNA，为后续检测提供样本；其次是 Sanger 测序技术，通过对真菌内部转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）等区域进行测序，准确鉴定菌株身份；最后是实时荧光定量 PCR 技术，针对Phyllosticta citriasiana设计特异性引物和探针，实现对两种真菌的精准检测 。研究中使用的柑橘果实样本来自 2005 年 1 月至 2024 年 10 月期间荷兰国家植物保护组织拦截的 273 批有 CBS 或 CTS 症状的柑橘果实托运货物，以及从当地超市获取的无症状柑橘果实。
实时荧光定量 PCR 性能特征
研究人员对新开发的Phyllosticta citriasiana实时荧光定量 PCR 检测方法进行了全面评估。通过对多种真菌和细菌分离物的检测，结果显示该方法具有高度的分析特异性，仅能检测到Phyllosticta citriasiana，对其他已知出现在柑橘果实上的物种均未产生假阳性结果。同时，该方法的检测限低至 2.92 pg DNA，在不同实验室技术人员之间的检测结果具有高度的可重复性和再现性，这表明该检测方法准确可靠，能够在实际检测中发挥重要作用。
欧盟进口水果中Phyllosticta citricarpa和Phyllosticta citriasiana的存在情况
利用两种实时荧光定量 PCR 检测方法，研究人员对大量柑橘果实病斑进行检测后发现，Phyllosticta citriasiana仅出现在柚（Citrus maxima）果实上，而Phyllosticta citricarpa则只存在于除柚之外的其他柑橘属水果上，二者从未同时被检测到。携带Phyllosticta citricarpa的柑橘果实来自南非、巴西等多个国家，携带Phyllosticta citriasiana的果实主要来自中国、越南和泰国。
Phyllosticta citriasiana宿主分布的文献综述
研究人员查阅大量文献后发现，在 2009 年Phyllosticta citriasiana被描述之后，文献中关于Phyllosticta citricarpa在柚上的报道很少。而且，在对这些报道进行核查时发现，部分存在真菌或宿主物种鉴定错误的情况，还有一些难以确定其准确性。
综合研究结果，研究人员得出结论：Phyllosticta citricarpa和Phyllosticta citriasiana在柑橘属水果上的宿主特异性明显。这一发现意义重大，为柑橘黑斑病的诊断提供了更准确的依据。基于此，研究人员建议重新将基于症状和病原菌形态的直接鉴定方法纳入非柚类柑橘果实上 CBS 的诊断流程，同时调整欧洲和地中海植物保护组织（EPPO）以及国际植物保护公约（IPPC）的诊断协议。新开发的Phyllosticta citriasiana实时荧光定量 PCR 检测方法，能够快速、灵敏且特异地检测该病原菌，有助于更好地了解其全球分布情况，为柑橘种植者和植物保护工作者制定更有效的防控策略提供有力支持，从而保障全球柑橘产业的健康可持续发展。这场与柑橘病害的 “战斗”，因为这项研究成果，让我们看到了胜利的希望，未来，我们有望更精准地守护柑橘果园，让柑橘摆脱病害的困扰，茁壮成长。
