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为解决实时监测植物组织内病原菌受限，影响杀菌剂合理筛选与精准应用的问题，研究人员开展构建表达荧光素酶基因的致病疫霉（Phytophthora infestans）菌株及相关应用研究。结果建立了相关筛选评估体系，意义在于推动杀菌剂研发与精准使用。
在农业生产的舞台上，植物病原菌和害虫就像一群隐藏在暗处的 “破坏者”，时刻威胁着全球粮食的生产与供应。据估算，全球高达 40% 的农作物产量因它们的侵害而受损，每年仅病原菌造成的经济损失就约达 2200 亿美元。为了抵御这些 “破坏者”，农药的使用成为现代农业的重要手段，它能减少 30% - 40% 的作物损失。然而，随着人口的增长、病原菌对杀菌剂抗性的不断增强以及全球极端气候的增多，研发新的、更有效的杀菌剂并实现精准应用迫在眉睫。
目前，化合物和新配方的大规模筛选工作困难重重。在实验室中，精准量化病原菌对于评估杀菌剂的效果至关重要，但传统的评估方法存在诸多弊端。比如，依靠感染面积和疾病指数的主观评估容易产生人为误差，尤其是在评估多汁水果和厚块茎样本时；而像聚合酶链反应（PCR）、免疫荧光（IF）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和质谱（MS）等实验室技术，不仅需要专业的操作和数据分析技能，还往往需要对样本进行破坏性采集，难以获取同一样本的时间进程数据，不适合大规模的定量筛选。
在这样的背景下，南京农业大学的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们成功构建了一种表达荧光素酶基因（luc）的致病疫霉（Phytophthora infestans）稳定菌株（PiLuc），并以此为基础建立了基于成像技术的杀菌剂筛选新方法。该研究成果发表在《Plant Methods》上，为农业领域杀菌剂的研发和应用带来了新的曙光。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先通过密码子优化，对萤火虫荧光素酶基因序列进行改造，以增强其在致病疫霉中的表达；然后利用农杆菌介导转化（AMT）技术，将优化后的基因导入致病疫霉 JH19 菌株中；采用生物发光检测技术，对转化菌株及相关样本进行检测；还运用了蛋白质免疫印迹（Western blotting）、Southern 印迹杂交（Southern blotting）等分子生物学技术对转化菌株进行鉴定 。
下面来看看具体的研究结果：
- luc 标记致病疫霉菌株的构建：优化后的 luc 基因与萤火虫 luc 基因核苷酸序列相似度为 76.29%，通过农杆菌介导转化成功获得了染色体插入且遗传稳定的 PiLuc 菌株。该菌株在生长、孢子囊、游动孢子表型和感染能力方面与野生型 JH19 菌株无差异，且优化后的 luc 基因在致病疫霉的各个发育阶段均持续表达。
- 96 孔板化学杀菌剂高通量筛选：利用 PiLuc 菌株在 96 孔板中对氟啶胺、氰霜唑和霜脲氰等杀菌剂进行筛选。结果显示，这三种杀菌剂对 PiLuc 菌株的生长抑制呈剂量依赖性，且氰霜唑的抑制效果显著高于其他两种杀菌剂。该方法还可用于比较不同化合物的抑制率，能实现对化合物抑制特性的快速、大规模量化。
- PiLuc 监测早期感染区域：通过接种马铃薯块茎和番茄果实，发现 PiLuc 菌株能在早期感染阶段检测到肉眼不可见的感染区域，且在不同番茄品种中表现出不同的定植水平，表明 PiLuc 可灵敏地追踪病原菌在多种宿主组织中的定植动态。
- 生物发光定量检测病原菌生物量：在叶片感染模型中，PiLuc 的生物发光信号与病原菌生物量呈强线性相关，但在块茎感染模型中相关性不显著，说明该方法在叶片感染检测中较为可靠，在复杂几何结构的宿主组织检测中存在一定局限性。
- 杀菌剂在马铃薯块茎上的评估：建立了针对马铃薯块茎的杀菌剂评估平台，发现 100 g/L 氰霜唑悬浮剂（SC）和 687.5 g/L 氟吡菌胺?霜霉威盐酸盐悬浮剂能显著抑制 PiLuc 在马铃薯块茎表面的生物发光。不同浓度的氟吡菌胺?霜霉威盐酸盐悬浮剂处理显示出剂量依赖性的抑制效果。
在研究结论和讨论部分，该研究构建的 luc 标记致病疫霉菌株及基于此的成像技术筛选方法，实现了病原菌的精确可视化和定量分析，在 96 孔板和宿主植物中均展现出良好的应用效果。密码子优化提高了荧光素酶基因的表达效率，且其在不同发育阶段表达稳定。96 孔板筛选方法高效且经济，减少了实验时间和劳动力成本。生物发光成像技术在较大观察尺度上提升了对感染过程的理解，为植物病理学研究提供了有价值的数据。不过，该技术在块茎感染样本的病原菌生物量定量分析中存在不足，后续还需探索更合适的样本制备技术。总体而言，这项研究为杀菌剂的合理开发和精准应用提供了有力的技术支持，对保障全球粮食安全具有重要意义，有望推动农业领域在病原菌监测和杀菌剂研发方面取得新的突破 。
