敲除 fis 基因：调控多杀性巴氏杆菌毒力及开发疫苗的新突破

多杀性巴氏杆菌（P. multocida）严重危害动物健康，造成经济损失。研究人员针对 fis 基因开展研究，发现敲除 fis 可下调其毒力，且该敲除菌株能对 A、B 血清型菌株产生交叉免疫保护，为疫苗开发提供新方向。

　　在动物健康领域，多杀性巴氏杆菌（P. multocida）可谓是个 “麻烦制造者”。它能引发多种动物疾病，像偶蹄动物的出血性败血症、家禽的禽霍乱、猪的萎缩性鼻炎等。不同血清型的多杀性巴氏杆菌产生的荚膜多糖各不相同，而荚膜作为重要的毒力因子，对细菌生存至关重要。此前研究虽发现 fis（factor for inversion stimulation，一种与核区相关的蛋白）可正向调节多杀性巴氏杆菌荚膜糖胺聚糖基因转录，但 fis 调控多杀性巴氏杆菌毒力的具体机制却尚不明确。为了解开这一谜团，西南大学的研究人员踏上了探索之旅，相关研究成果发表在《BMC Veterinary Research》杂志上。

研究人员开展了一系列实验，主要运用了同源重组技术构建基因工程菌株，实时定量 PCR（RT-qPCR）检测基因转录水平，以及免疫实验评估疫苗效果等关键技术。实验样本中的多杀性巴氏杆菌菌株，包括高毒力的牛源多杀性巴氏杆菌 A 血清型 CQ2（PmCQ2）和 B 血清型菌株 B（PmB） ，PmCQ2 分离自重庆患肺炎小牛的肺脏，PmB 购自中国兽医药品监察所。

研究结果如下：

• 细菌荚膜与毒力的关系及基因工程菌株构建：通过对前期研究数据整理分析，发现多杀性巴氏杆菌的荚膜与半数致死量（LD₅₀）呈显著负相关。利用同源重组策略，成功构建了 fis 基因敲除菌株（Δfis）、过表达菌株（O-fis）和互补菌株（C-fis），并通过 PCR、RT-PCR 和 Western Blot 等方法进行了验证。
• Δfis 菌株的特性：与野生型菌株 PmCQ2 相比，Δfis 菌株菌落更小，在不同培养基中生长速度改变，荚膜含量显著降低，生物膜含量显著升高，且无法摄取培养基中额外添加的结合铁，其多个血红蛋白受体的转录受到抑制，这表明 fis 基因影响细菌生长、荚膜生物合成及结合铁的摄取。
• 致病性分析：感染实验显示，接种 Δfis 的小鼠存活率显著高于接种 PmCQ2 的小鼠，Δfis 的 LD₅₀比 PmCQ2 高 2.37×10⁸倍。感染 Δfis 的小鼠肺部促炎细胞因子 TNF-α 和 IL-6 水平显著降低，肺部细菌载量也明显低于感染 PmCQ2、C-fis 和 O-fis 的小鼠。体外实验表明，Δfis 对巨噬细胞的抗吞噬能力显著下降。
• Δfis 菌株的交叉保护作用：免疫实验发现，活 Δfis 免疫小鼠产生的血清 IgG 抗体滴度显著高于灭活 Δfis 免疫的小鼠。活 Δfis 能对 PmCQ2（A 血清型）和 PmB（B 血清型）产生强大的免疫保护，而灭活 Δfis 对 PmB 的保护水平较低 。活 Δfis 免疫小鼠后，血清 IgG 抗体滴度在 30 天达到高峰并持续稳定至 90 天。

研究结论和讨论部分指出，fis 基因在多杀性巴氏杆菌中调控荚膜产生、生物膜形成和毒力，首次证实 fis 通过调节多个血红蛋白受体来控制结合铁离子的摄取。Δfis 菌株毒力大幅降低，炎症反应减轻，且能对 A、B 血清型多杀性巴氏杆菌产生交叉免疫保护，有望开发成为针对多杀性巴氏杆菌 A、B 血清型的减毒疫苗候选菌株 。该研究不仅揭示了 fis 基因在多杀性巴氏杆菌致病过程中的关键作用，还为防控多杀性巴氏杆菌感染提供了新的策略和理论依据，在动物健康保护领域具有重要意义。